[发明专利]一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用，其步骤为：刺激细胞→阻断细胞膜表面Fc受体→细胞膜表面抗原染色→细胞固定→细胞透膜→胞内或核内抗原染色→流式细胞分析等步骤，可以对Th细胞表面及胞内染色，并获得较好的实验效果。可应用于测试Th1、Th2、Th17细胞占CD4+细胞的比例。

主权项

一种Th细胞表面及胞内染色的方法，其特征在于：其步骤为：1）在一支流式测定管中加1ml肝素抗凝全血和1ml无菌的含10％小牛血清的RPMI1640培液混匀；2）在上述管中再加入佛波酯2ul，离子霉素2ul，莫能菌素2ul；盖上盖子，在37℃，5％的CO2培养箱中培育不超过3.5小时；3）在3个流式管子内，分别加入IFN‑γ/CD4/IL‑4体系，标记为IL‑4，加入IFN‑γ/CD4/IL‑17体系，标记为IL‑17，以及阴性对照管；取步骤2）的全血培养液轻缓颠倒混匀，取出600μl分别加到三个流式管子中；4）每根流式管子加4ml无菌红细胞裂解液，颠倒混匀数次，放置10min，裂解红细胞；5）将裂解红细胞后的样本离心1,500rpm，5min，弃上清；6）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗沉淀，离心1,500rpm，5min，弃上清加标记抗体PE‑Cy5‑CD4抗体10μl，阴性管不要加，4℃避光孵育30min；7）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次洗涤，离心1,500rpm，5min，弃上清，控干；8）每管加冷固定剂：500μl，4%多聚甲醛；固定20min，避光放置；9）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗，离心1,500rpm，5min，弃上清；加500μl，1％的皂素穿膜剂，避光放置10min；10）1,500rpm，5min，离心弃上清；11）在标记为IL‑4的管子中加FITC‑IFN‑γ抗体0.5ug，PE‑IL‑4抗体0.125ug，在IL‑17的管子中FITC‑IFNγ抗体0.5ug,PE‑IL‑17抗体0.25ug；12）将上述3根流式管子放在暗室中，室温孵育过夜后，上流式仪器检测。