[发明专利]一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用

权利要求书

1.一种Th细胞表面及胞内染色的方法，其特征在于：其步骤为：

1）在一支流式测定管中加1ml肝素抗凝全血和1ml无菌的含10％小牛血清的RPMI1640培液混匀；

2）在上述管中再加入佛波酯2ul，离子霉素2ul，莫能菌素2ul；盖上盖子，在37℃，5％的CO₂培养箱中培育不超过3.5小时

；

3）在3个流式管子内，分别加入IFN-γ/CD4/IL-4体系，标记为IL-4，加入IFN-γ/CD4/IL-17体系，标记为IL-17，以及阴性对照管；取步骤2）的全血培养液轻缓颠倒混匀，取出600μl分别加到三个流式管子中；

4）每根流式管子加4ml无菌红细胞裂解液，颠倒混匀数次，放置10min，裂解红细胞；

5）将裂解红细胞后的样本离心1,500rpm，5min，弃上清；

6）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗沉淀，离心1,500rpm，5min，弃上清加标记抗体PE-Cy5-CD4抗体10μl，阴性管不要加，4℃避光孵育30min；

7）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次洗涤，离心1,500rpm，5min，弃上清，控干；

8）每管加冷固定剂：500μl，4%多聚甲醛；固定20min，避光放置；

9）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗，离心1,500rpm，5min，弃上清；加500μl，1％的皂素穿膜剂，避光放置10min；

10）1,500rpm，5min，离心弃上清；

11）在标记为IL-4的管子中加FITC-IFN-γ抗体0.5ug，PE-IL-4抗体0.125ug，在IL-17的管子中FITC-IFNγ抗体0.5ug,PE-IL-17抗体0.25ug；

12）将上述3根流式管子放在暗室中，室温孵育过夜后，上流式仪器检测。