[发明专利]一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用，属于内分泌技术领域。

背景技术

自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease，AITD)为器官特异性自身免疫性疾病，以对甲状腺抗原自我耐受被破坏为特征。桥本氏甲状腺炎（Hashimoto’s thyroidtis,HT）与Graves病(GD)均属于典型的自身免疫性甲状腺疾病，甲状腺中均有多量淋巴细胞以及浆细胞、NK细胞和巨噬细胞浸润，以HT淋巴细胞的浸润最为广泛。目前普遍认为，HT是由于抑制性T淋巴细胞功能降低，辅助性T淋巴细胞作用增强，使B淋巴细胞分化产生大量抗甲状腺抗体，其中最常见的是抗过氧化物酶抗体(TPOAb)，通过抗体依赖性和自然杀伤细胞介导的细胞毒作用导致甲状腺组织结构破坏和甲状腺功能低下为主要特点。

CD4⁺T细胞是机体执行免疫应答的重要细胞，初始CD4⁺T细胞受抗原刺激被激活后，可在不同的细胞因子微环境下分化为效应细胞Thl、Th2、Thl7或调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg）。Th1细胞主要释放IFN-γ、IL-12、TNF-β等细胞因子，激活巨噬细胞、中性粒细胞等，发挥细胞毒及吞噬效应，介导细胞免疫。Th2细胞主要分泌的细胞因子有IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，促进B细胞释放IgG、IgA、IgE抗体，介导体液免疫。Thl7细胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6和IL-9等，实验动物模型显示Th17细胞与器官特异性自身免疫性炎症反应关系密切。Treg细胞则特异性抑制CD4^＋、CD8^＋T细胞的活化和增殖，从而阻止自身免疫反应的发生。在免疫应答过程中，免疫细胞间可通过所分泌的细胞因子而相互刺激，彼此约束，从而对免疫应答进行调节。

细胞因子作为免疫细胞调节剂、免疫效应分子、炎性反应促进剂参与、调节、影响、促进这一过程。细胞因子的改变，在AITD患者中提示Thl／Th2功能有异常，这种异常可影响调节甲状腺细胞功能网络系统的活动，促进甲状腺抗体形成增多，促使AITD的发生，发展。

普遍认为Th1型细胞因子所介导的细胞免疫反应在HT发病中起主要作用。其中代表性的细胞因子为IFN-γ。它一方面促进甲状腺内的淋巴细胞浸润，另一方面促进浸润的淋巴细胞和巨噬细胞活化并释放TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子以及氧自由基的产生，这些物质可造成甲状腺组织破坏。

GD的发生与促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的产生有直接的关系，它是引起GD的主要和直接原因。TRAb属于IgG1亚类，而Th2型细胞因子促进IgG1亚类的产生。GD的免疫反应呈Th2型，其免疫应答以体液免疫为主。TRAb模拟TSH的作用过度刺激甲状腺滤泡细胞，导致甲状腺功能亢进^[3]。Th细胞有多种亚型，包括能分泌IL-17A的Th17亚型，在器官特异性自身免疫性炎症的实验模型中显示出重要意义。

而如何从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子，是相关领域有待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用，以提供一种从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种Th细胞表面及胞内染色的方法，其步骤为：

1）在一支流式测定管中加1ml肝素抗凝全血和1ml无菌的含10％小牛血清的RPMI1640培液混匀。

2）在上述管中再加入佛波酯2ul，离子霉素2ul，莫能菌素2ul；盖上盖子，在37℃，5％的CO₂培养箱中培育不超过3.5小时（千万不要超过3.5小时，否则CD4细胞得率降低。盖子不要盖太紧）。

3）在3个流式管子内，分别加入IFNγ/CD4/IL4体系，标记为IL-4，加入IFN-γ/CD4/IL-17体系，标记为IL-17，以及阴性对照管（不加任何抗体）。取步骤2）的全血培养液轻缓颠倒混匀，取出600μl分别加到三个流式管子中。

4）每根流式管子加4ml无菌红细胞裂解液，颠倒混匀数次，放置10min，裂解红细胞。

5）将裂解红细胞后的样本离心1,500rpm，5min，弃上清。

6）每管加1ml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗沉淀，离心1,500rpm，5min，弃上清加标记抗体PE-Cy5-CD4抗体10μl，阴性管不要加，4℃避光孵育30min。