[发明专利]多级PCR检测HPV的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了多级PCR检测HPV的方法和试剂盒。本发明方法通过在全封闭体系中，用两对或多对HPV特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的HPV基因组DNA，并通过测序等方法准确地确定HPV的型别。本发明方法可简便地在多级PCR过程中的各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，并可有效消除PCR交叉干扰，使作为临床检测的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。

主权项

1.一种非诊断且非治疗性的鉴别人乳头瘤病毒HPV型别的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以HPV基因组DNA为模板，通过HPV特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1；(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过HPV特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2；(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过HPV特异性的第i+1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物Pi+1，其中i为≥2的正整数；本步骤可进行一次或多次；(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i+1扩增产物Pi+1，进行测序，从而获得HPV的序列；和(e)将测得的HPV序列与HPV标准序列进行比对，从而鉴别出HPV的型别；且在步骤(a)中，第一级PCR隔室中放置有可携带PCR扩增产物的固体颗粒，从而在PCR反应过程中或之后，形成携带PCR扩增产物的固体颗粒；并且所述的固体颗粒是磁性微球；且所述的方法还包括：在步骤(b)和(c)中，利用磁铁或电磁铁，通过所述携带PCR扩增产物的固体颗粒，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室转移至第j+1级PCR隔室，其中j为≥1的正整数；并且在步骤(a)、(b)和(c)的整个过程中，所有的PCR隔室都处于封闭状态；在步骤(b)和(c)中，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室转移至第j+1级PCR隔室过程中，第j级PCR隔室和第j+1级PCR隔室都处于完全封闭状态，其中j为≥1的正整数，并且在第j级PCR隔室和第j+1级PCR隔室之间设有完全封闭的或可完全封闭的连接通道，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从Pj级隔室或上游隔室转移至Pj+1级隔室或下游隔室；且所述的方法在多级PCR反应管中进行，所述的多级PCR反应管的隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道(40)，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒(50)从通过一个隔室转移至另一隔室；且所述的隔室具有腔盖(20)，并且对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，就构成一个封闭空间。