[发明专利]多级PCR检测HPV的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种非诊断且非治疗性的鉴别人乳头瘤病毒HPV型别的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以HPV基因组DNA为模板，通过HPV特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1；

(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过HPV特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2；

(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过HPV特异性的第i+1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物P_i+1，其中i为≥2的正整数；本步骤可进行一次或多次；

(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i+1扩增产物P_i+1，进行测序，从而获得HPV的序列；和

(e)将测得的HPV序列与HPV标准序列进行比对，从而鉴别出HPV的型别；

且在步骤(a)中，第一级PCR隔室中放置有可携带PCR扩增产物的固体颗粒，从而在PCR反应过程中或之后，形成携带PCR扩增产物的固体颗粒；并且所述的固体颗粒是磁性微球；

且所述的方法还包括：在步骤(b)和(c)中，利用磁铁或电磁铁，通过所述携带PCR扩增产物的固体颗粒，将第j扩增产物P_j从第j级PCR隔室转移至第j+1级PCR隔室，其中j为≥1的正整数；

并且在步骤(a)、(b)和(c)的整个过程中，所有的PCR隔室都处于封闭状态；

在步骤(b)和(c)中，将第j扩增产物P_j从第j级PCR隔室转移至第j+1级PCR隔室过程中，第j级PCR隔室和第j+1级PCR隔室都处于完全封闭状态，其中j为≥1的正整数，并且在第j级PCR隔室和第j+1级PCR隔室之间设有完全封闭的或可完全封闭的连接通道，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从P_j级隔室或上游隔室转移至P_j+1级隔室或下游隔室；

且所述的方法在多级PCR反应管中进行，所述的多级PCR反应管的隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道(40)，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒(50)从通过一个隔室转移至另一隔室；

且所述的隔室具有腔盖(20)，并且对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，就构成一个封闭空间。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的隔室呈矩阵排列，所述矩阵为a×b矩阵，其中a为2-100的正整数，b为2-100的正整数。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接通道位于反应腔或隔室上部；

并且当所述上游隔室盖上腔盖后，所述连接通道在上游隔室的入口隔室上部，并且位于腔盖下沿下方，从而使得携带PCR扩增产物的固体颗粒被抬升从而离开位于隔室下方的反应体系后，进入所述入口，经过连接通道，再通过所述连接通道在下游隔室的出口，进入下游隔室。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一引物对选自下组：简并引物MY09/11及其改进型PGMY09/11；SPF1/2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对选自下组：

MY11/GP6；PGMY11/GP6；MY11/GP6+；PGMY11/GP6+；

MY09/GP5；PGMY09/GP5；MY09/GP5+；PGMY09/GP5+；和/或

当i＝2时，步骤(c)中使用第三引物对进行扩增，且所述的第三引物对选自下组：通用引物GP5和GP6；GP5+和GP6+。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，将GP5、GP6、GP5+和/或GP6+作为通用引物，进行测序。