[发明专利]多级PCR检测HPV的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了多级PCR检测HPV的方法和试剂盒。本发明方法通过在全封闭体系中，用两对或多对HPV特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的HPV基因组DNA，并通过测序等方法准确地确定HPV的型别。本发明方法可简便地在多级PCR过程中的各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，并可有效消除PCR交叉干扰，使作为临床检测的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。

技术领域

本发明涉及生物和检测领域，具体地，本发明涉及多级PCR检测HPV的方法和试剂盒及其应用。

背景技术

人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。已知，人乳头瘤病毒(HPV)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。

HPV在99%宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。

已确定了很多的乳头瘤病毒序列，见此处引用作为参考的出版物：HPV-6：deVilliers等人，J.Virology，40(1981)；HPV-11：Dartmann等人，Virology151，124-130(1986)；HPV-16：Seedorf等人，Virology145，181-185(1985)；HPV-18：Cole和Danos，Journal of Molecular Biology93，599-608(1987)；HPV-31：Goldsborough等人，Virology171，306-311(1989)；HPV-33：Cole和Streeck，J.Virology，58，991-995(1986)；HPV-54：Favre等人，J.Cancer45，40-46(1990)；HPV-56：J.，Gen.Virol.70，3099(1989)。

DNA检测是测定一种灵敏的检测HPV的方法。主要包括三类：

第一类是直接探针结合法，如有HPV类型特异性探针的Sourthern印迹和点印迹等法。但其缺点是低灵敏度、操作繁琐费时及需要大量纯化的HPV探针。

第二类是信号放大法，如杂交捕获法(Digene公司)和bDNA法(Bayer公司)。杂交捕获(HybridCapture)法是美国Digene公司的检测HPV DNA的技术(HC2)，是目前美国获得FDA批准并在国际上临床最广泛使用的一种检测HPV DNA的检测技术，HC2可以检测出混合高危型HPV，该试剂盒用的是一套核酸杂交信号扩增 系统杂交捕获二代试验(HC2)HPV DNA检测试剂，能同时检测13种高危型HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。然而，HC2最大的缺点是，不能检测出单一高危HPV基因型。当同一高危HPV型持续感染病人时，则感染者患宫颈癌的机率显著增加，此时，HC2的用途就极其有限了。另外，HC2检测存在着高比率的假阴性和假阳性。

第三类方法是基于PCR的靶序列片段扩增技术，应用PCR对特异性HPV靶序列片段进行扩增，用型特异性的寡核苷酸探针鉴别HPV型别。HPV DNA检测法的优点是：取样简便，检测及结果报告人为因素影响极少，适合在宫颈癌高危人群中进行大规模的初筛。但存在与HC2类似的缺点。

该类目前主要检测方法有：特异性PCR(Type-specific PCR)法：该法根据E6、E7基因的变异区设计型特异性的引物进行PCR分析(Walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个HPV拷贝每反应，随HPV型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份PCR，则导致无法高通量的使用。

PCR是涉及通过多个循环，指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的，并且已经被广泛使用。