[发明专利]一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法

摘要

本发明以金铁锁植株幼嫩叶或茎为外植体，成功诱导金铁锁愈伤组织，并建立了光照和暗培养条件下的金铁锁愈伤组织培养体系，诱导愈伤组织分化产生不定根，建立金铁锁不定根培养体系。并对金铁锁总皂苷的含量进行测定，进一步优化植物细胞培养的条件和参数，建立金铁锁高产细胞培养体系，从而实现金铁锁植物细胞规模化培养生产不定根替代金铁锁原植物入药。

主权项

一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于具体步骤如下：（1）植物材料的选取与消毒处理选取金铁锁叶或切成1~3cm的小段的金铁锁茎为外植体，并对其进行消毒处理；（2）植物愈伤组织的诱导将步骤（1）中外植体接种于诱导培养基，在 25±1℃下培养，在25天时挑选质地松散、生长良好的愈伤组织用于继代培养；（3）植物愈伤组织的继代培养取步骤（2）中得到的愈伤组织0.5g接种于组织培养用培养基，进行继代培养2~4次，每隔 15天继代一次，在 (25±1)℃下培养；（4）不定根的诱导及继代培养采用不定根诱导培养基对步骤（3）中得到的愈伤组织进行不定根诱导培养，在25±1 ℃下培养；待成功诱导出不定根后，对不定根进行继代培养两次以上，每隔 20 天继代一次，继代培养具体方法如下：将成团生长的金铁锁不定根捣碎，剔除颜色发黑、生长老化的部分，取生长比较旺盛、颜色较浅的不定根接种于内装100mL培养基的 250mL 的三角瓶中，每瓶的接种量为鲜重1.0g 左右，在普通摇床中振荡培养，转速为 100r/min，温度为 25℃；（5）生物反应器大规模培养金铁锁不定根将步骤（4）中经继代培养的成团的金铁锁不定根捣碎，剔除其老化部分，作为反应器培养的材料，每个反应器装有 500mL MS 液体培养基，pH 值 6.0，含有 3%蔗糖、1‑2mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激动素，接种量为 5g 左右，整个操作在超净台内完成，然后在温度为 25℃，通气量为0.020‑0.035 vvm的条件下进行大规模培养。