[发明专利]一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法

权利要求书

1.一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）植物材料的选取与消毒处理

选取金铁锁叶或切成1~3cm的小段的金铁锁茎为外植体，并对其进行消毒处理；

（2）植物愈伤组织的诱导

将步骤（1）中外植体接种于诱导培养基，在 25±1℃下培养，在25天时挑选质地松散、生长良好的愈伤组织用于继代培养；

（3）植物愈伤组织的继代培养

取步骤（2）中得到的愈伤组织0.5g接种于组织培养用培养基，进行继代培养2~4次，每隔 15天继代一次，在 (25±1)℃下培养；

（4）不定根的诱导及继代培养

采用不定根诱导培养基对步骤（3）中得到的愈伤组织进行不定根诱导培养，在25±1 ℃下培养；待成功诱导出不定根后，对不定根进行继代培养两次以上，每隔 20 天继代一次，继代培养具体方法如下：将成团生长的金铁锁不定根捣碎，剔除颜色发黑、生长老化的部分，取生长比较旺盛、颜色较浅的不定根接种于内装100mL培养基的 250mL 的三角瓶中，每瓶的接种量为鲜重1.0g 左右，在普通摇床中振荡培养，转速为 100r/min，温度为 25℃；

（5）生物反应器大规模培养金铁锁不定根

将步骤（4）中经继代培养的成团的金铁锁不定根捣碎，剔除其老化部分，作为反应器培养的材料，每个反应器装有 500mL MS 液体培养基，pH 值 6.0，含有 3%蔗糖、1-2mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激动素，接种量为 5g 左右，整个操作在超净台内完成，然后在温度为 25℃，通气量为0.020-0.035 vvm的条件下进行大规模培养。

2.根据权利要求1所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：步骤（1）中所述消毒处理的具体步骤为：

1）对材料进行流水冲洗；

2）用吐温20浸泡25min，无菌水冲洗3次；

3）用0.1% HgCl₂处理8min，无菌水洗冲3次；

4）再用75%乙醇处理8s，无菌水冲洗3次；

5) 用无菌滤纸吸干水分。

3.根据权利要求1所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：步骤（1）中所述金铁锁茎被切成1.6-2.0cm长。

4.根据权利要求1所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：步骤（2）中所述诱导培养基为MS 培养基+ 2，4-D 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L + KT 0.1mg/L + 半胱氨酸0~2.0mg/L，pH=6.0。

5.根据权利要求1所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：步骤（3）中所述愈伤组织继代培养基为：MS 培养基+ 蔗糖40g/L + KNO₃ 1.9 g/L + NH₄NO₃ 1.65 g/L + KH₂PO₄ 1 mmol/L + CaCl₂ 4.5mmol/L。

6.根据权利要求1所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：步骤（4）中所用的培养基为附加 3%蔗糖、1-2mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激动素的 MS培养基。

7.根据权利要求4所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：步骤（2）中所述诱导培养基中的半胱氨酸的含量为1.5 mg/L。

8.根据权利要求1所述的金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法，其特征在于：在用生物反应器进行大规模培养之前对不定根不同根系进行筛选及扩繁从而选择最优不定根系进行大规模培养，其具体步骤如下：

对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优不定根系。

9.根据权利要求5所述的筛选步骤，其特征在于：所述最优不定根系为颜色呈黄褐色、生长旺盛的健壮不定根系。