[发明专利]一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用植物组织培养技术诱导与培养不定根系的方法，特别涉及一种金铁锁状不定根系的诱导与生物反应器扩大培养方法。

 

背景技术

金铁锁(Psammosilene tuniceoides W. C. Wu et C. Y. Wu)为石竹科金铁锁属植物，是我国西南地区特有的药用植物。金铁锁主要以根入药，临床上常用于治疗类风湿性关节炎等疾病。金铁锁主要化学成分是三萜、三萜皂苷、环肽以及内酰胺。药理试验表明，金铁锁总皂苷镇痛和抗炎效果明显。传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种濒危甚至灭绝。近年来由于金铁锁的市场需求不断增加，野生植物资源数量急剧下降，已成为珍稀濒危物种。

为了解决药用植物的供需矛盾，人们多采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，一些药用植物生产周期很长，若以常规方法育种或育苗，需要花费较长时间。还有一些药用植物因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加。另外一些药用植物，则因病毒危害导致退化，严重影响了产量和品质。

为保证药用植物资源的可持续利用，利用生物工程的途径对珍贵资源进行细胞或组织培养、有效成分的关键基因克隆与转化等技术，可能是解决中药产业化的有效途径。于是，积极研究药用植物资源的再生技术，使有限的资源为人类持续利用迫在眉睫。应用植物组织培养生产药用植物，具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势，同时组织培养中的细胞生长速度要比植物正常生长速度快，接近于分生组织的生长速度，因此利用组织培养手段快速繁殖药用植物种苗，或者利用组织培养或细胞培养手段直接生产药物便随之日益发展。

在金铁锁植物细胞培养方面，欧阳志勤等进行了金铁锁离体培养和快速繁殖试验，他们将金铁锁茎尖、带芽的茎段诱导分化和培养得到植物芽、带芽茎段和愈伤组织无根苗，进一步增殖培养，无根苗形成试管苗。杨耀文等对金铁锁进行了组织培养和快速繁殖研究，他们以金铁锁幼嫩茎段为外植体，从而获得组织培养苗。为了实现金铁锁的快速繁殖，他们进一步使用正交试验探讨不同生长调节剂对其增殖的影啊和最佳培养条件的筛选，发现 MS 培养基+ BA 0.5mg/L + KT 0.1mg/L + IAA 0.1mg/L + 2，4-D 0.5mg/L培养基，培养温度19.5±1℃，光照强度1200Lx，光照周期12小时为最优培养条件。

但是到目前为止，金铁锁植物细胞培养还停留在离体培养和快速繁殖研究层面，还未见有关利用植物细胞培养技术培养金铁锁组织，金铁锁次生代谢产物皂苷的细胞内合成途径，以及通过综合调控技术提高金铁锁植物细胞生物量，进而提高金铁锁总皂苷等次生代谢产物含量方面的报道。主要问题是对金铁锁植物细胞培养的生长稳定性、培养条件和各种调节参数、细胞生长与次生代谢产物积累的矛盾研究不足。

本发明建立了金铁锁愈伤组织和不定根培养体系，大大降低愈伤的褐化率并提高愈伤诱导率，确定了愈伤组织和不定根的生长周期，通过植物细胞培养获得其药用成分皂苷。进一步优化了细胞愈伤组织培养和悬浮培养的条件和参数，促使植物细胞次生代谢向着有利于皂苷类物质合成的方向进行，进而提高皂苷类物质含量。为金铁锁不定根利用生物反应器大规模培养及生产奠定了基础。组织培养技术特别是大规模工业化培养技术， 对解决药用植物资源紧张的现状具有重要意义。

 

发明内容

本发明目的在于通过组织培养技术和发酵工程技术手段大量生产金铁锁不定根，以得到金铁锁次生代谢产物，从而替代野生资源，以保证中药的可持续利用。本发明以金铁锁植株幼嫩茎为外植体，成功诱导金铁锁愈伤组织，并建立了光照和暗培养条件下的金铁锁愈伤组织培养体系，并诱导产生不定根，建立金铁锁不定根培养体系。进而对金铁锁总皂苷的含量进行测定，建立金铁锁高产细胞培养体系，以实现金铁锁植物细胞规模化培养生产不定根替代金铁锁原植物入药。

本发明所述技术方案的具体步骤如下：

（1）植物材料的选取与消毒处理

选取金铁锁叶或切成1~3cm的小段的金铁锁茎为外植体，并对其进行消毒处理。所述消毒过程如下：

1）对材料进行流水冲洗；

2）用吐温20浸泡25min，无菌水冲洗3次；

3）用0.1% HgCl₂处理8min，无菌水洗冲3次；

4）再用75%乙醇处理8s，无菌水冲洗3次；

5) 用无菌滤纸吸干水分。

（2）植物愈伤组织的诱导