[发明专利]一种毛竹体细胞胚胎发生的方法

摘要

本发明公开了一种毛竹(Phyllostachys heterocycla var.pubescens)体细胞胚胎发生的方法，它是通过对外植体进行适宜消毒后，在诱导培养基上诱导出愈伤组织，愈伤组织经增殖培养后首先在分化培养基上形成胚状体，然后胚状体在萌发培养基上完成萌发并形成再生植株，最后再生植株经壮苗培养、炼苗后移栽成活。本发明解决了毛竹体细胞胚胎发生的技术难题，为实现以毛竹为代表的散生竹类的生物技术育种提供了技术平台。

主权项

一种毛竹(Phyllostachys heterocycla var.pubescens)体细胞胚胎发生的方法，其特征包括：外植体消毒，愈伤组织诱导与增殖，胚状体诱导、萌发与植株再生，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下：(1)外植体消毒：选择健康饱满的种实，先用75％(v/v)的乙醇处理1分钟；再用每升加5‑6滴吐温‑80的0.2％次氯酸钠处理15‑20分钟；然后用无菌水冲洗数次；最后用无菌纸吸干表面水分后接种；(2)愈伤组织诱导与增殖：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，暗培养20‑30天使愈伤组织形成，愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1‑8mg/L的2，4‑D、0.1‑5mg/L的ZT、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的愈伤组织分离出来，接种到继代培养基上增殖培养70‑90天，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1‑8mg/L的2，4‑D、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；(3)胚状体诱导、萌发与植株再生：将增殖培养后的愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，暗培养20‑40天，使胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1‑8mg/L的ZT、1‑3mg/L的BA、1‑5mg/L的KT、30g/L的麦芽糖、10g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到分化培养基上，光照培养30‑50天，胚状体逐渐萌发形成再生植株；分化培养是以MS培养基为基础，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的卡拉胶；光照时间12小时/日，光照强度800‑2000lux；(4)壮苗、炼苗和移栽：将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基上培养50‑60天，开瓶炼苗5‑7天，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；所述的壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1‑4mg/L的NAA、0.2‑0.5mg/L的TDZ、10g/L的卡拉胶。