[发明专利]乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法

摘要

本发明公开了一种乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，属于生物工程技术领域。体外合成包括目的基因hBPI的CDS序列，该CDS序列上游添加了XhoI酶切位点、Kozak序列、牛β-酪蛋白信号肽，下游添加了XhoI酶切位点；并将此体外合成序列定向克隆至经XhoI酶切的pBC1-loxp-neo-loxp-pBD载体；经菌液PCR和测序验证，获得了构建正确的人杀菌/通透性增强蛋白乳腺特异表达载体pBC1-loxp-Neo-loxp-hBPI。本发明经细胞C-127水平的功能验证表明该载体基因构建合理、有效，这将为成功制作动乳腺生物反应器生产hBPI蛋白奠定了坚实的基础。

主权项

乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，包括如下步骤：(1)设计合成如下序列：XhoI酶切位点+Kozak序列+牛β‑酪蛋白信号肽+人BPI的CDS序列+XhoI酶切位点，体外合成并克隆至pUC57载体的EcoRV酶切位点处，命名为pUC57‑hBPI；(2)使用限制性内切酶SalI分别酶切pUC57‑hBPI、pBC1‑loxp‑neo‑loxp‑pBD；胶回收插入pUC57载体的体外合成的外源片段、pBC1‑loxp‑Neo‑loxp片段；使用T4连接酶连接上述回收的片段；(3)上述连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布至氨苄抗性平板，挑单菌落摇菌；设计引物hBPI1/hBPI2、hBPI3/hBPI4、hBPI5/hBPI6，使用菌液PCR法快速鉴定；所述引物如下：上游hBPI1：5’‑ACCATGAAGGTCCTCATCCTT‑3’，锚钉在插入序列的5’末端；下游hBPI2：5’‑ATAGACAACGTCTGCACCGAA‑3’，锚钉在插入序列的3’末端；上游hBPI3：5’‑TCTTTGGTTCCTTTTAAAG‑3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；下游hBPI4：5’‑TCCATCACTGGTGGAGCAAA‑3’，锚钉在插入序列的5’末端；上游hBPI5：5’‑CTTTGGTTCCTTTTAAAGGGAAG‑3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；下游hBPI6：5’‑TTTGTAGGGCTCTTAATTACTCA‑3’，锚钉在载体上XhoI 插入位点下游骨架序列匹配；将上述引物使用菌液PCR鉴定后全为阳性的克隆进行测序，最终得到测序完全正确的阳性克隆pBC1‑loxp‑Neo‑loxp‑hBPI。