[发明专利]乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法无效
| 申请号： | 201210100640.0 | 申请日： | 2012-04-07 |
| 公开（公告）号： | CN102676581A | 公开（公告）日： | 2012-09-19 |
| 发明（设计）人： | 张运海;章孝荣;桂涛;李运生;刘亚;陈建文;章美玲;张宇;刘星;方富贵;丁建平 | 申请（专利权）人： | 安徽农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/66 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 230036 *** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 乳腺 特异 表达 杀菌 通透 增强 蛋白 载体 构建 方法 | ||
1.乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，包括如下步骤：
(1)设计合成如下序列：XhoI酶切位点+Kozak序列+牛β-酪蛋白信号肽+人BPI的CDS序列+XhoI酶切位点，体外合成并克隆至pUC57载体的EcoRV酶切位点处，命名为pUC57-hBPI；
(2)使用限制性内切酶SalI分别酶切pUC57-hBPI、pBC1-loxp-neo-loxp-pBD；胶回收插入pUC57载体的体外合成的外源片段、pBC1-loxp-Neo-loxp片段；使用T4连接酶连接上述回收的片段；
(3)上述连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布至氨苄抗性平板，挑单菌落摇菌；设计引物hBPI1/hBPI2、hBPI3/hBPI4、hBPI5/hBPI6，使用菌液PCR法快速鉴定；
所述引物如下：
上游hBPI1：5’-ACCATGAAGGTCCTCATCCTT-3’，锚钉在插入序列的5’末端；
下游hBPI2：5’-ATAGACAACGTCTGCACCGAA-3’，锚钉在插入序列的3’末端；
上游hBPI3：5’-TCTTTGGTTCCTTTTAAAG-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；
下游hBPI4：5’-TCCATCACTGGTGGAGCAAA-3’，锚钉在插入序列的5’末端；
上游hBPI5：5’-CTTTGGTTCCTTTTAAAGGGAAG-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；
下游hBPI6：5’-TTTGTAGGGCTCTTAATTACTCA-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点下游骨架序列匹配；
将上述引物使用菌液PCR鉴定后全为阳性的克隆进行测序，最终得到测序完全正确的阳性克隆pBC1-loxp-Neo-loxp-hBPI。
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