[发明专利]乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法

说明书

[技术领域]

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，该方法用于制备转基因动物乳腺生物反应器。

[背景技术]

人杀菌通/透性增强蛋白(hBPI)是由Weiss等人于1978年首次从人中性粒细胞(PMN)的嗜苯胺蓝颗粒中分离得到，hBPI基因全长编码区包含1464个碱基对，翻译后由456个氨基酸残基组成分子量大小为55～60KD左右的蛋白，其结构与内毒素结合蛋白类似，它能与游离的LPS或革兰氏阴性菌细胞外膜膜LPS结合，结合所形成的BPI-LPS复合物能阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应，起到中和内毒素和杀灭细菌作用。人的PMNs(polymorphonuclear neutrophils)中诸多抗菌成分中，BPI是唯一既能够对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用又可以中和内毒素作用的抗菌肽类物质，而对革兰氏阳性菌和真核细胞没有杀伤作用，此外，BPI还有促进补体活化、增强吞噬调理作用，抑制血管生成、抑制炎性介质释放、减轻内毒素血症和防止休克发生等生物学作用，被称为“超级抗生素”。因其本身为人体抗菌成分，不会引起机体免疫反应，因此BPI在临床上具有广阔的应用前景。

天然的BPI不仅来源有限，而且提取方法复杂、获得量低、价格昂贵，由于人们对蛋白结构与功能之间关系认识的局限，人工化学合成的BPI蛋白多为线性或含有简单二级结构的多肽，不能够很好的模拟杀菌和抗内毒素功能，BPI分子由于其抗菌活性，特别是抗革兰阴性菌活性，大肠杆菌不适宜作为其表达的宿主菌，因此其表达研究一直以真核细胞、酵母等真核表达为主，真核表达虽然具有活性高的优点，但产量较低、表达周期长、成本高。目前重组BPI及其衍生物在应用上存在着活性不高、半衰期短、用药剂量大，严重影响其临床应用。转基因乳腺生物反应器是指通过转基因技术将外源基因导入动物基因组并在乳腺特异表达重组蛋白，动物乳腺作为一个专门化的外分泌腺体，其天然高效合成、分泌蛋白的能力很强，可以对表达的蛋白进行一系列加工修饰，因而动物乳腺作为生物反应器生产重组蛋白具有活性高、产量高、易于纯化等优点，被认为是生产重组药用蛋白理想的“加工场”。

当前，动物乳腺生物反应器研制面临的突出问题是成功率不高、表达水平偏低，试验周期较长，研制成本较高。基因构件是制备动物乳腺生物反应器上游关键材料之一，直接影响目的基因的表达水平。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供了一种乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，包括如下步骤：

(1)设计合成如下序列：XhoI酶切位点+Kozak序列+牛β-酪蛋白信号肽+人BPI的CDS序列+XhoI酶切位点，体外合成并克隆至pUC57载体的EcoR V酶切位点处，命名为pUC57-hBPI；

(2)使用限制性内切酶Sal I分别酶切pUC57-hBPI、pBC1-loxp-neo-loxp-pBD；胶回收插入pUC57载体的体外合成的外源片段、pBC1-loxp-Neo-loxp片段；使用T4连接酶连接上述回收的片段；

(3)上述连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布至氨苄抗性平板，挑单菌落摇菌；设计引物P1、P2、P3，使用菌液PCR法快速鉴定；

所述引物具体情况如下：

上游hBPI1：5’-ACCATGAAGGTCCTCATCCTT-3’，锚钉在插入序列的5’末端；

下游hBPI2：5’-ATAGACAACGTCTGCACCGAA-3’，锚钉在插入序列的3’末端；

上游hBPI3：5’-TCTTTGGTTCCTTTTAAAG-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；

下游hBPI4：5’-TCCATCACTGGTGGAGCAAA-3’，锚钉在插入序列的5’末端；

上游hBPI5：5’-CTTTGGTTCCTTTTAAAGGGAAG-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；

下游hBPI6：5’-TTTGTAGGGCTCTTAATTACTCA-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点下游骨架序列匹配；

将引物hBPI1/hBPI2、hBPI3/hBPI4、hBPI5/hBPI6，菌液PCR鉴定为阳性的克隆送基因测序，得到阳性的克隆pBC1-loxp-Neo-loxp-hBPI。

本发明的有效果是：