[发明专利]一种哲罗鲑体细胞体外培养方法

摘要

一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，涉及一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。本发明提供了一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。方法：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织；三、原代培养组织块；四、细胞的原代培养；五、体细胞传代培养，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。本发明方法培养的细胞生长状态良好。本发明方法可有效地增加细胞分裂次数，使得哲罗鲑体外细胞的实际分裂次数达到30次以上。

主权项

一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D‑Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D‑Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块：将清洗后的组织剪碎至0.8～1.2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50～100rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至105个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％～90％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×104～5×104个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。