[发明专利]一种哲罗鲑体细胞体外培养方法

权利要求书

1.一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块：将清洗后的组织剪碎至0.8～1.2mm³的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50～100rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至10⁵个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％～90％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×10⁴～5×10⁴个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。

2.根据权利要求1所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤一中断颈处死哲罗鲑的具体方法为：选择体长为12～14cm的哲罗鲑，采用医用尖头镊子插入哲罗鲑口中，另一只手握住其鱼体躯干部，采用背侧移位断颈处死。

3.根据权利要求1或2所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤二所述哲罗鲑鱼体组织为肝脏、肾脏、鳍缘或吻端。

4.根据权利要求3所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤二中采集哲罗鲑鱼体组织的具体方法为：采用碘酒擦拭哲罗鲑鱼体表一次，然后将哲罗鲑浸泡于体积浓度为75％的乙醇溶液中30秒，取出后用灭菌纱布吸干鱼体表面，取全部或部分组织。

5.根据权利要求4所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤三中第二次在19℃的培养箱中继续培养期间，每48小时更换细胞培养液一次。

6.根据权利要求5所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤三、步骤四和步骤五中所述细胞培养液为含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20％的胎牛血清的B2培养基。

7.根据权利要求6所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤四中所述胰蛋白酶消化液为含有质量浓度0.25％的胰蛋白酶的D-Hanks缓冲液。

8.根据权利要求7所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤四中置于19℃培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。

9.根据权利要求8所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤五中置于19℃培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。

10.根据权利要求9所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤五中消化细胞培养瓶内细胞的方法为：用D-Hanks缓冲液将细胞丰度达到80％～90％的细胞培养瓶冲洗2遍后，加入1mL 0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液，5分钟后加入1mL血清终止消化。