[发明专利]一种哲罗鲑体细胞体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。

背景技术

哲罗鲑(Hucho taimen)为我国珍贵、冷水性鱼类之一，主要分布在亚洲北部地区，西至伏尔加河流域、东至伯朝拉河流域、南至黑龙江流域，北至勒拿河等流域。哲罗鲑大部分时间生活在水流湍急的溪水中，冬季在较深的水体如大江干流、湖泊中越冬，春季向溪流洄游产卵。由于繁殖期过度捕捞，使哲罗鲑补充群体数量大大减少，以及人为环境污染及生存环境条件破坏等原因，使哲罗鲑的自然资源量显著下降。目前，黑龙江的哲罗鲑数量较过去显著减少，在黑龙江省的渔获物中几乎不占比重。自2005年我国哲罗鲑人工繁殖和苗种驯化成功后，该鱼因其生长速度快、易驯养、营养价值高等优点，而被广泛养殖，涉及到全国20几个省市县。近些年，随着哲罗鲑养殖规模的扩大、由于种质衰退和养殖环境恶化等原因，一些冷水性鱼类的暴发性疾病频频爆发，导致我国哲罗鲑等冷水性鱼类的养殖产量锐减。目前，国内外学者虽对哲罗鲑生态习性、生长繁殖、生化和遗传等方面进行了大量的研究，但对其细胞培养方面的研究还尚未见报道。

发明内容

本发明提供一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。

本发明哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块：将清洗后的组织剪碎至0.8～1.2mm³的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50～100rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至10⁵个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％～90％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×10⁴～5×10⁴个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。

冷水性鱼类因其具有独特的生长环境和代谢机制，其细胞培养一直以来是国内外鱼类细胞培养的技术难点。因此，为解决我国冷水性鱼类病毒性疾病检测和疫苗制备的迫切需要，本发明建立了哲罗鲑体细胞的体外培养方法，对促进我国冷水性鱼类的渔业健康、稳定发展具有重要的实践意义。本发明方法培养的细胞生长状态良好。本发明方法可有效地增加细胞分裂次数，使得哲罗鲑体外细胞的实际分裂次数达到30次以上。

附图说明

图1为具体实施方式十一中培养鉴定的活细胞在可见光下的形态图；图2为具体实施方式十一中培养鉴定的活细胞PI染色后荧光下的形态图；图3为具体实施方式十一中培养鉴定的活细胞hoechst33342染色后荧光下的形态图；图4为具体实施方式十一中的死细胞在可见光下的形态图；图5为具体实施方式十一中培养鉴定的死细胞PI染色后荧光下的形态图；图6为具体实施方式十一中培养鉴定的死细胞hoechst33342染色后荧光下的形态图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。