[发明专利]一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法

摘要

本发明公开了一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，是利用pcDNA3.1(+)构建Smac/DIABLO基因突变型载体质粒pcSIG；然后将pcSIG质粒线性化，通过显微注射注入合子的原核中，培养，再移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；用Real-time PCR验证得到的转基因小鼠F1代是否有突变基因的表达，最终获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型。本发明方法获得的Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠模型可以作为耳聋治疗药物的筛选平台，并利用所述模型分析，能够揭示致病基因突变导致耳聋的分子机制，为下一步预防和治疗提供有力支持。

主权项

一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，步骤是：(1)利用pcDNA3.1(+)构建载体：将Smac/DIABLO基因的cDNA序列连入载体pcDNA3.1(+)的KpnI和BamHI两个酶切位点之间，将IRES‑eGFP序列连入载体pcDNA3.1(+)的EcoRV和XhoI两个酶切位点之间；设计诱变引物扩增PCR引入c.371C＞T突变；经过测序验证突变后，用KpnI和XhoI双酶切已诱变的质粒中的cDNA+IRES‑eGFP片段和空质粒pcDNA3.1(+)，再进行连接、转化、培养、提质粒，构建得到Smac/DIABLO基因突变型载体质粒——pcSIG，所述pcSIG质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其中，上述诱变引物序列是：M371‑F：GAAGATGAATTTCCAGGAGGAAG，M371‑R：CCAAGTAAAC TTGTATATTGTCGGT；(2)原核注射和胚胎移植建立转基因小鼠模型：将突变型载体质粒pcSIG线性化，通过显微注射注入合子的原核中，37℃培养1～3h，然后将注射质粒并培养存活的合子移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；其中，上述PCR扩增引物序列是：cDNA‑F：GCGGTACCATGGCGGCTCTGAGAAGT，eGFP‑R：GCCTCGAGTTAC TTGTACAGCTCGTC；(3)对得到的转基因小鼠进行基因型鉴定：用Real‑time PCR验证得到的转基因小鼠F1代是否有突变基因的表达，若有，即确定获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型；其中，上述Real‑time PCR引物序列是：cDNA‑RT‑F：CACCTACGCGCTGATTGAAG，cDNA‑RT‑R：CTGCCACACCTCAT CTTCCT。