[发明专利]一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法无效
| 申请号： | 201210073854.3 | 申请日： | 2012-03-20 |
| 公开（公告）号： | CN102604991A | 公开（公告）日： | 2012-07-25 |
| 发明（设计）人： | 高建刚;张剑;袁慧军;卢宇;程静;朱玉华 | 申请（专利权）人： | 山东大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/12;C12Q1/68;A01K67/027 |
| 代理公司： | 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 | 代理人： | 李健康 |
| 地址： | 250100 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 smac diablo 基因突变 转基因 小鼠 模型 制备 方法 | ||
1.一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，步骤是：
(1)利用pcDNA3.1(+)构建载体：将Smac/DIABLO基因的cDNA序列连入载体pcDNA3.1(+)的KpnI和BamHI两个酶切位点之间，将IRES-eGFP序列连入载体pcDNA3.1(+)的EcoRV和XhoI两个酶切位点之间；设计诱变引物扩增PCR引入c.371C＞T突变；经过测序验证突变后，用KpnI和XhoI双酶切已诱变的质粒中的cDNA+IRES-eGFP片段和空质粒pcDNA3.1(+)，再进行连接、转化、培养、提质粒，构建得到Smac/DIABLO基因突变型载体质粒——pcSIG，所述pcSIG质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
其中，上述诱变引物序列是：
M371-F：GAAGATGAATTTCCAGGAGGAAG，
M371-R：CCAAGTAAAC TTGTATATTGTCGGT；
(2)原核注射和胚胎移植建立转基因小鼠模型：将突变型载体质粒pcSIG线性化，通过显微注射注入合子的原核中，37℃培养1～3h，然后将注射质粒并培养存活的合子移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；
其中，上述PCR扩增引物序列是：
cDNA-F：GCGGTACCATGGCGGCTCTGAGAAGT，
eGFP-R：GCCTCGAGTTAC TTGTACAGCTCGTC；
(3)对得到的转基因小鼠进行基因型鉴定：用Real-time PCR验证得到的转基因小鼠F1代是否有突变基因的表达，若有，即确定获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型；
其中，上述Real-time PCR引物序列是：
cDNA-RT-F：CACCTACGCGCTGATTGAAG，
cDNA-RT-R：CTGCCACACCTCAT CTTCCT。
2.如权利要求1所述Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，其特征是：所述pcDNA3.1(+)载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2；所述Smac/DIABLO基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3；所述IRES-eGFP的核苷酸序列如SEQ ID No.4。
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