[发明专利]共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备

摘要

本发明涉及一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于：首先分别设计针对H1N1和H3N2亚型SIVHA及FMD2A引物序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体pAdTrack连接，进行同源重组，经PCR和酶切鉴定得重组腺病毒质粒；将得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293T细胞，包装后将得到的病毒原液感染293T细胞或MDCK细胞。该重组腺病毒为H3、H1亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为进一步研究开发基因工程疫苗奠定了基础。2009年3月至今，流行于全球许多国家人群中的H1N1亚型流感进一步突出了SI在人类公共卫生方面具有的潜在危害性，研制高效、安全的疫苗为SI的防制提供物质储备。

主权项

共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于：首先分别设计针对H1N1和H3N2亚型SIV HA及FMD 2A引物序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体pAdTrack连接，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组腺病毒穿梭载体转化入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy‑1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行同源重组，经PCR和酶切鉴定得重组腺病毒质粒；将得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293T细胞，进行重组腺病毒的包装；包装后将得到的病毒原液感染293T细胞或MDCK细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并通过PCR方法鉴定，具体步骤如下：1) 根据GeneBank上H1N1和H3N2亚型SIV HA及FMD 2A序列设计引物；2）HA序列与pAdTrack载体连接，转化，挑去菌落，应用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR，酶切及测序鉴定结果显示该重组腺病毒穿梭质粒构建成功；3）重组腺病毒穿梭质粒与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组腺病毒质粒后转染293T细胞进行包装；4）将转然后得到的病毒原液感染293T细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并提取细胞基因组DNA，通过PCR方法检测HA基因序列；5) 用重组病毒免疫 6 周龄的雌性昆明鼠，在二免后两周用H1N1和H3N2 SIV进行攻毒，测攻毒后免疫保护率以评价该重组病毒对小鼠的免疫保护效果。