[发明专利]共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，特别是涉及一种共表达H1N1与H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白重组腺病毒的构建；两种血凝素之间的linker FMDV 2A为重组腺病毒中不同血凝素蛋白的单独表达提供了新的手段，为H3、H1亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为进一步研究开发基因工程疫苗奠定了基础。 

背景技术

猪流感（swine  influenza,  SI）是由猪流感病毒（SIV）引起的一种急性高度接触性传染病，单独感染发病率高、死亡率低，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪传染性胸膜肺炎等并发或继发感染，导致患病动物生产性能下降或死亡，给养猪业造成较大经济损失。除此之外，猪作为人流感和禽流感病毒的“混合器”，在流感病毒种间传播及流行病学研究中占据重要地位。近来，H1N1、H1N2和H3N2亚型流感病毒一直在世界猪群中共同流行，猪流感的病原学和血清学调查显示， H1N1和H3N2亚型已成为在我国猪群中广泛流行的优势毒株。 

目前,主要是通过接种疫苗来预防该病的发生。常规灭活疫苗对该病的免疫防制存在不足之处 ,而弱毒疫苗则存在潜在的生物安全问题。因此，开发新型、高效、廉价、安全的疫苗势在必行。随着分子生物学技术的飞速发展，学者们不断进行着新型基因工程流感疫苗的研究。HA蛋白为SIV的表面糖蛋白，病毒感染后能够诱导机体产生特异性抗HA蛋白的抗体，该抗体具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作为重要的靶抗原。 

腺病毒表达系统具有稳定且易调控、表达外源抗原活性高、免疫途径广泛、安全高效等优点。多种人类和动物病原基因的重组腺病毒的成功构建与应用结果表明重组腺病毒能够诱导机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应,能够抵御相应病原的致死性侵袭 ,在动物疫苗方面显示出良好的应用前景。 

FMDV 2A具有自剪切功能，2个外源基因之间以2A序列连接形成一个完整的ORF。翻译时融合蛋白可在编码2A区域的C端被2A切开，将融合蛋白切割分离为两个独立的蛋白（Mattion et al.,1996）。FMDV 2A基因其短小的基因序列和2A高效的自剪切效率为二价基因疫苗的研制提供了新的手段。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其构建一株以FMD 2A为linker共表达H1N1与H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白重组腺病毒，为H3、H1亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为SIV腺病毒活载体疫苗的研制奠定基础，采用第三代腺病毒载体，它突出的优点是缺失全部的腺病毒蛋白编码序列，感染后没有病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应和细胞毒性，提高了安全性。 

本发明的技术方案是这样实现的：共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于：首先分别设计针对H1N1与H3N2亚型猪流感病毒HA蛋白及FMD 2A的基因序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体连接，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组穿梭质粒转化入含有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌BJ5183感受态进行同源重组，获得重组腺病毒质粒；然后用PacⅠ线性化后转染293细胞，在293细胞内包装出重组腺病毒；通过荧光显微镜观察、PCR检测，证明血凝素基因已成功克隆入腺病毒载体。并通过小鼠免疫试验验证获得的重组腺病毒可以同时对此两种亚型猪流感的攻击提供一定的保护。 

具体步骤如下： 

1.    针对H1N1和H3N2亚型SIV HA基因及FMD 2A基因的设计

从GenBank上下载H1N1和H3N2亚型SIV毒株HA1基因及FMD 2A的序列，扩增基因的特异性引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成设计。见表1针对H1N1和H3N2亚型SIV毒株HA1基因及FMD 2A基因的引物序列。

  

2.    重组穿梭载体的构建

将扩增得到的H1HA1-2A与酶切线性化的pAdTrack载体16℃连接过夜，将连接产物转化入DH5α感受态细胞中，通过PCR、酶切筛选正确克隆,将得到的重组穿梭载体质粒线性化后与H3HA1连接并转化入DH5α感受态细胞，经鉴定得到重组腺病毒穿梭质粒。如图1所示。

3.    重组腺病毒质粒的构建及重组腺病毒的获得