[发明专利]共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备

权利要求书

1.共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于：首先分别设计针对H1N1和H3N2亚型SIV HA及FMD 2A引物序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体pAdTrack连接，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组腺病毒穿梭载体转化入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行同源重组，经PCR和酶切鉴定得重组腺病毒质粒；将得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293T细胞，进行重组腺病毒的包装；包装后将得到的病毒原液感染293T细胞或MDCK细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并通过PCR方法鉴定，具体步骤如下：1) 根据GeneBank上H1N1和H3N2亚型SIV HA及FMD 2A序列设计引物；2）HA序列与pAdTrack载体连接，转化，挑去菌落，应用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR，酶切及测序鉴定结果显示该重组腺病毒穿梭质粒构建成功；3）重组腺病毒穿梭质粒与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组腺病毒质粒后转染293T细胞进行包装；4）将转然后得到的病毒原液感染293T细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并提取细胞基因组DNA，通过PCR方法检测HA基因序列；5) 用重组病毒免疫 6 周龄的雌性昆明鼠，在二免后两周用H1N1和H3N2 SIV进行攻毒，测攻毒后免疫保护率以评价该重组病毒对小鼠的免疫保护效果。

2.根据权利要求1所述的一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于所述的HA基因与含有CMV启动子的腺病毒穿梭载体pAdTrack组建成重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-H1-2A-H3。

3.根据权利要求2所述的一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于所述的重组腺病毒载体的构建如下：1）制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，2）将得到的重组腺病毒穿梭质粒经限制性内切酶Pme I单酶切后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行同源重组，挑取阳性克隆进行PCR及酶切鉴定。

4.根据权利1所述的一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于两种目的基因之间以FMDV 2A为linker，FMDV 2A具有自剪切功能，翻译时融合蛋白可在编码2A区域的C端被2A切开，分别表达为两个独立的蛋白。