[发明专利]一种从细菌中分离纯化大质粒的方法

摘要

一种从细菌中分离纯化大质粒的方法，属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明首先将细菌包埋在低熔点琼脂糖凝胶中，然后在胶内用溶菌酶对细菌进行破菌，用蛋白酶消化胶内细菌的蛋白，再利用脉冲场凝胶电泳对细菌的DNA进行分离，最后通过胶回收获得细菌中的大质粒DNA。通过本发明分离纯化获得的大质粒DNA具有纯度高、结构完整等特点。本发明对于研究细菌中大质粒的生物学特性和功能，以及改造和开发利用细菌中的大质粒，都具有极其重要的作用。

主权项

一种从细菌中分离纯化大质粒的方法，其特征在于步骤为：（1）培养细菌：挑取单个菌落接种于4ml LB液体培养基，37℃振荡过夜培养后离心，收集菌体；（2）制作胶块：用PIV缓冲液（10mM Tris，1M NaCl， PH7.6）洗涤后，取1ml PIV缓冲液重悬细菌，与1ml 2％的低熔点琼脂糖凝胶混匀，温度保持在50℃，灌入胶块浇制槽中制作细菌胶块；（3） 消化蛋白：将胶块放入新鲜溶菌液Lysis buffer中37℃轻摇过夜，ES缓冲液洗涤模块后用ESP缓冲液50℃过夜消化已去除蛋白质；所述Lysis buffer的成分为6mM Tris，0.1M EDTA ，1M NaCl，0.5％Brij‑58，0.2％脱氧胆酸钠，0.5％SDS， RNaseA 20μg/ml，溶菌酶1mg/ml；所述ESP缓冲液是含蛋白酶K100μg/ml 的ES缓冲液；（4）电泳分离：用TE缓冲液充分洗涤上述经ESP缓冲液消化过夜的胶块，最后胶块上脉冲场凝胶电泳仪进行电泳，电泳条件为：电压6V/cm，角度120°，起始转换时间范围：1‑10s，最后转换时间范围为20‑60s，电泳时间范围为6‑24h，电泳液缓冲液为0.5×TBE，温度保持在14℃；电泳后经EB染色以观察大质粒和染色体的分离情况；（5）切胶回收： ①用手术刀切取含目的大质粒DNA的琼脂糖凝胶块并称重，先加入3倍胶重的溶胶液QX1，再加入2倍胶重的双蒸水；②振荡30秒使QIAEXⅡ颗粒重悬，如果胶块中的DNA总量不超过2μg，则向样品溶胶液中加入10μl的QIAEXⅡ颗粒，然后50℃保温10min，每两分钟振荡一次使颗粒重悬，让胶块充分熔化释放出DNA结合到QIAEXⅡ颗粒上；此时混合物的颜色应为黄色，如果是橙色或紫色的话，应加入pH 5.0 3M的乙酸钠溶液调节其颜色至黄色，同时再继续保温至少5min；③13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之；④加入QX1缓冲液500μl，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之，此步以洗去残留的凝胶；⑤加入500μl缓冲液TE，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之，此步以洗去残留的盐分；⑥室温干燥10‑15分钟，直到颗粒变白，加入pH 8.5 10mM Tris‑HCl 缓冲液20μl以溶解大质粒DNA，取2μl 进行普通琼脂糖凝胶电泳以鉴定所提取的质粒DNA的纯度，其余于‑20℃保存备用。