[发明专利]一种从细菌中分离纯化大质粒的方法

说明书

技术领域

一种从细菌中分离纯化大质粒的方法，属于生物化学与分子生物学技术领域。可用于细菌大质粒的提取和鉴定。

背景技术

质粒是染色体外可以进行自我复制的遗传元件，大小范围从1kb至200kb以上不等，广泛存在于各类生物体的细胞中，尤其在细菌中更为常见，编码细菌生存非必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等，一般不整合到细菌染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是分子生物学重组DNA技术中重要的工具。分离提取细菌中的质粒是研究和改造质粒的第一步，对于大小在10kb以内的小质粒通常采用碱裂解法提取质粒DNA，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子由于较小能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；染色体DNA由于较大不容易复性而与蛋白质一起呈絮状，离心时可沉淀下来。因此对于细菌中的大质粒，由于其大小和染色体相比差别没有小质粒那么大，所以传统的碱裂解法用于提取细菌中的大质粒并不奏效。

发明内容

为了克服传统的碱裂解法不能用于提取细菌大质粒的不足，本发明提供了一种简单实用的从细菌中分离纯化大质粒的方法。该方法利用脉冲场凝胶电泳技术结合胶回收法能有效的提取细菌中的大质粒DNA。

本发明所采用的技术方案是：

（1）培养细菌：挑取单个菌落接种于4ml LB液体培养基，37℃振荡（250rpm）过夜培养后离心（4000rpm, 10min, 4℃），收集菌体。

（2）制作胶块：用PIV缓冲液（10mM Tris，1M NaCl， PH7.6）洗涤后，取1ml PIV缓冲液重悬细菌，与1ml 2％的低熔点琼脂糖凝胶混匀（温度保持在50℃），灌入胶块浇制槽中制作细菌胶块。

（3） 消化蛋白：将胶块放入新鲜溶菌液Lysis buffer （6mM Tris，0.1M EDTA ，1M NaCl，0.5％Brij-58，0.2％脱氧胆酸钠，0.5％SDS， RNaseA 20μg/ml，溶菌酶1mg/ml）中37℃轻摇过夜，ES缓冲液（0.5M EDTA ，1％SDS）洗涤模块后用ESP缓冲液（含蛋白酶K100μg/ml 的ES）50℃过夜消化已去除蛋白质。

（4）电泳分离：用TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）洗涤上述经ESP缓冲液消化过夜的胶块，最后胶块上脉冲场凝胶电泳仪进行电泳，电泳条件为：电压6V/cm，角度120°，起始转换时间范围：1-10s，最后转换时间范围为20-60s，电泳时间范围为6-24h，电泳液缓冲液为0.5×TBE，温度保持在14℃。电泳后经EB染色以观察大质粒和染色体的分离情况。

（5）切胶回收： 

①用手术刀切取含目的大质粒DNA的琼脂糖凝胶块并称重，先加入3倍胶重的溶胶液QX1，再加入2倍胶重的双蒸水。

②振荡30秒使QIAEXⅡ颗粒重悬。如果胶块中的DNA总量不超过2μg，则向样品溶胶液中加入10μl的QIAEXⅡ颗粒，然后50℃保温10min，每两分钟振荡一次使颗粒重悬，让胶块充分熔化释放出DNA结合到QIAEXⅡ颗粒上。此时混合物的颜色应为黄色，如果是橙色或紫色的话，应加入pH 5.0 3M的乙酸钠溶液调节其颜色至黄色，同时再继续保温至少5min。

③13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。

④加入QX1缓冲液500μl，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。此步以洗去残留的凝胶。

⑤加入500μl缓冲液TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0），振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。此步以洗去残留的盐分。

⑥室温干燥10-15分钟，直到颗粒变白，加入pH 8.5 10mM Tris-HCl 缓冲液20μl以溶解大质粒DNA，取2μl 进行普通琼脂糖凝胶电泳以鉴定所提取的质粒DNA的纯度，其余于-20℃保存备用。

本发明的有益效果：本发明利用脉冲场凝胶电泳技术结合胶回收法能有效的分离纯化细菌中的大质粒DNA，克服了传统的碱裂解法不能用于提取细菌大质粒的弊端。本发明弥补了传统碱裂解法在提取细菌质粒上的不足，实现了细菌中大质粒的有效提取。对研究细菌中大质粒的生物学特性和功能，以及改造和开发利用细菌中的大质粒，都具有极其重要的作用。

附图说明