[发明专利]一种检测长链非编码RNA-HOTAIRM1的方法

摘要

本发明提供一种检测长链非编码RNA-HOTAIRM1的方法，根据长链非编码RNA-HOTAIRM1的基因序列以及内参基因GAPDH的基因序列设计并合成外侧引物、内侧引物和荧光探针，并利用这两套引物和探针特异性检测HOTAIRM1在血浆中的相对表达。经过研究，结果表明HOTAIRM1在正常结直肠粘膜组织中呈阳性表达，而且在胃癌组织和胃癌患者血浆中却表现为低表达，本发明对进一步研究HOTAIRM1在肿瘤中的表达和建立准确特异检测方法具有指导意义。

主权项

一种检测长链非编码RNA‑HOTAIRM1的方法，通过以下步骤实现：（1）采用RNA抽提试剂提取组织和血浆中总RNA，DNaseⅠ去除基因组DNA后采用逆转录试剂进行逆转录合成cDNA；（2）分别以HOTAIRM1和GAPDH的外侧引物按照以下PCR反应体系配制反应液：1×PCR buffer、0.1μM的外侧上下游引物引物、1U的DNA聚合酶、0.2mM的dNTPs，取2μL的cDNA模板，反应体积为20μL；按照95℃变性5分钟，95℃ 30秒、55℃ 30秒，72℃ 30秒进行15个循环预扩增；（3）取2.0μL预扩增产物加入如下PCR反应液中：1×TaqMan 通用PCR 缓冲液，0.2μM的内侧上下游引物引物和0.1μM的荧光探针，反应体积为10μL，按照95℃变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 1分钟，扩增40个循环；（4）根据荧光曲线读取Ct值，按照下述公式计算HOTAIRM1的相对表达量：HOTAIRM1相对表达量=2－ΔCt（ΔCt=Ct HOTAIRM1－Ct GAPDH）；所述特异性内外侧引物和荧光探针的序列分别如下：HOTAIRM1外侧引物：outer‑hotiarm1‑F: GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA，outer‑hotiarm1‑R：CAAACACCCACATTTCAACCC；HOTAIRM1内侧引物：inner‑hotiarm1‑F：GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT，inner‑hotiarm1‑R：CCCCATAAATCCCTCCACATT；HOTAIRM1荧光探针：hotiarm1‑probe: FAM‑CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA‑TAMRA GAPDH外侧引物：outer‑gapdh‑F：GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer‑gapdh‑R：GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT；GAPDH内侧引物：inner‑gapdh‑F：GCGTCTTCACCACCATGGA，inner‑gapdh‑R：TGGTTCACACCCATGACGAA；GAPDH荧光探针为：hotiarm1‑probe: FAM‑CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA‑TAMRA。