[发明专利]一种检测长链非编码RNA-HOTAIRM1的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人长链非编码RNA-HOTAIRM1检测方法。

背景技术

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200核苷酸的RNA分子，不具备编码蛋白质的功能的转录产物；最初被认为是基因组转录的“噪音”，RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有任何生物学功能。然而哺乳动物整个基因组普遍转录成转录本，但这些转录本中仅有很小一部分为编码蛋白质的mRNA，大部分为非编码RNA。非编码RNA包括结构RNA（如tRNA、rRNA和snRNA）、近年来成为研究热点的调节RNA（microRNA和siRNA）,以及最近科学界关注的lncRNA；在这些非编码RNA转录本中lncRNA占近80%，而且许多lncRNA具有mRNA样结构，经过剪切加工具有PolyA尾样结构，分化过程中出现动态表达和不同的剪切形式，呈现出时间特异和空间特异的表达方式，这些现象表明lncRNA的表达与降解在生物体内有着精细的调控机制。因此，lncRNA作为转录“噪音”和副产物的假说应该重新思考，lncRNA表达不仅在胚胎干细胞分化过程中特征性表达，而且在脑细胞中存在特定的亚细胞定位，同时这些lncRNA表达存在组织器官特异性。尽管仅有一小部分长链非编码RNA功能被阐释，但可以推测lncRNA通过某种机制参与了各种生物学功能，通过表观遗传学修饰、转录和翻译调控以及剪切拼接控制细胞周期、分化和凋亡等发挥生物学作用。显而易见，lncRNA 必定与疾病的发生发展机制密切相关，目前已经有报道表明肿瘤中存在差异表达的lncRNA，例如乳腺癌中HOTAIR表达升高， MALAT在肺癌和结直肠癌中过表达以及肝癌中HULC水平上升等。HOTAIRM1是最近发现的位于HOXA1和HOXA2基因间的长链非编码RNA，可能与造血系统中髓系细胞的发育和分化有关，而且在胎脑中也检测除其表达，并参与神经分化。

发明内容

    本发明目的是提供一种检测长链非编码RNA-HOTAIRM1的方法，是根据长链非编码RNA-HOTAIRM1的基因序列以及内参基因GAPDH的基因序列设计并合成外侧引物、内侧引物和荧光探针，并利用这两套引物和探针特异性检测HOTAIRM1在血浆中的相对表达。

本发明采用实时荧光PCR方法检测一种长链非编码RNA-HOTAIRM1，主要包括特异性外侧引物、内侧引物和荧光探针、逆转录试剂和荧光PCR试剂，通过以下步骤实现：

（1）采用RNA抽提试剂提取组织和血浆中总RNA，DNaseⅠ去除基因组DNA后采用逆转录试剂进行逆转录合成cDNA；

（2）分别以HOTAIRM1和GAPDH的外侧引物按照以下PCR反应体系配制反应液：1×PCR buffer、0.1μM的外侧上下游引物引物、1U的DNA聚合酶、0.2mM的dNTPs，取2μL的cDNA模板，反应体积为20μL；按照95℃变性5分钟，95℃ 30秒、55℃ 30秒，72℃ 30秒进行15个循环预扩增。

（3）取2.0μL预扩增产物加入如下PCR反应液中：1×TaqMan 通用PCR 缓冲液，0.2μM的内侧上下游引物引物和0.1μM的荧光探针，反应体积为10μL；按照95℃变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 1分钟，扩增40个循环；

（4）根据荧光曲线读取Ct值，按照下述公式计算HOTAIRM1的相对表达量：HOTAIRM1相对表达量=2^－ΔCt（ΔCt=Ct _HOTAIRM1－Ct _GAPDH）。

所述特异性内外侧引物和荧光探针的序列分别如下：

HOTAIRM1外侧引物：

outer-hotiarm1-F: GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA，

outer-hotiarm1-R：CAAACACCCACATTTCAACCC；

HOTAIRM1内侧引物：

inner-hotiarm1-F：GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT，

inner-hotiarm1-R：CCCCATAAATCCCTCCACATT；

HOTAIRM1荧光探针：

hotiarm1-probe: FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。

GAPDH外侧引物：

outer-gapdh-F：GGCGCTGAGTACGTCGTGGA,