[发明专利]一种荧光原位双杂交方法

摘要

本发明公开一种荧光原位双杂交方法，它对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片，通过生物素标记的探针与组织中的mRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。

主权项

1.一种荧光原位双杂交方法，其特征是：它包括以下具体步骤是：1）用含有H₂O₂终浓度为2%的摩尔浓度为0.1mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室温，10-15分钟；所述的H₂O₂终浓度为2%，所述的0.1mol/LDEPC-PB:是用磷酸氢二钠29.0克，磷酸二氢钠2.9克，用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；2）用摩尔浓度为0.1mol/L的DEPC-PB孵育步骤1）中处理过的切片1次，室温，10-20分钟；3）用含有TritonX-100终浓度为0.3%的摩尔浓度为0.1mol/L的DEPC-PB孵育步骤2）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的TritonX-100终浓度为0.3%；4）50ml的乙酰化液孵育步骤3）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；5）摩尔浓度为0.1mol/LDEPC-PB孵育步骤4）中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；6）在杂交液中孵育步骤5）中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60℃，所需时间1-2小时；7）在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和FITC标记的探针的终浓度为1ug/ml,杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火温度来确定；8）从步骤7）所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60℃，各20-30分钟；9）用RNA缓冲液孵育步骤8）中处理过的切片1次，37℃，20-30分钟；10）用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9）中处理过的切片，37℃，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml；11）用2XSSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37℃，各20-30分钟；12）用0.2xSSC孵育步骤11）中处理过的切片2次，37℃，各20-30分钟；13）用TS7.5孵育步骤12）中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7.5是由摩尔浓度为0.1mol/LTris-HCl,PH7.5,摩尔浓度为0.15mol/LNaCl溶液用超纯水配制而成；14）用TBS封闭将步骤13）中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS:是由TS7.5和体积百分比为1%的BlockingReagent配制而成；15）按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤14）中处理过的切片，室温，过夜；　16）用TNT于室温洗涤步骤15）中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；所述的TNT:是由TS7.5和体积百分比为0.05%Tween20配制而成；17）用摩尔浓度为0.1mol/L的PB洗涤步骤16）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；18）TSA-Biotin反应，放大杂交信号：将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10-15分钟；在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/ml-D葡萄糖，于室温孵育30分钟；19）用0.1mol/L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10-20分钟；20）在NaN₃的终浓度为2%的0.1mol/L的PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温，10-15分钟；21）用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；22）按1:2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21)中处理过的切片，过夜；23）用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；24）TSA-DNP反应：根据试剂盒的说明书操作，按照1：50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；25）用TNT洗涤步骤24)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；26）用TNT按照2种荧光抗体：Alexa488-DNP和Streptavidin-Cy3的效价1：200同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片2-4小时；27）用TNT洗涤步骤26)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；28）将步骤27)中处理过的切片表片，封片。