[发明专利]一种荧光原位双杂交方法

说明书

技术领域

本发明涉及荧光原位杂交，特别涉及一种荧光原位双杂交方法，属于生物医学领域。

背景技术

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA(或RNA)上,并用荧光素分子标记的单克隆抗体与探针分子特异性结合，来检测DNA序列在染色体或DNA(或RNA)上的定性、定位。国内外的荧光原位杂交应用主要在于临床方面，用来检验基因染色体位点变异，如慢性粒细胞白血病bcr/abl易位DNA探针和实体肿瘤检测的HER-2/neu基因探针。然而对组织中目的基因mRNA水平的定位及表达差异变化的研究方面应用甚少，目前缺乏一套稳定的体系来进行检测。在以往的FISH研究中，由于探针自身信号的强弱不同，杂交信号的显示存在不足。尽管采用的荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜对杂交结果进行观察，仍然不能很好地克服杂交信号显示不清楚的问题。在双标荧光原位杂交的方法的应用中，仍局限于临床染色体异常检测方面，如检测人精子染色体数目异常、检测星形细胞瘤染色体17p13.1的丢失等。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光原位双杂交方法，对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片后，该方法通过生物素标记的探针与组织中的mRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。

 本发明的技术方案是设计一种荧光原位双杂交方法，其特征是：它包括以下具体步骤是：  一种荧光原位双杂交方法，其特征是：它包括以下具体步骤是： 

1）用含有H₂O₂终浓度为2%的摩尔浓度为0.1 mol/L的 DEPC-PB 孵育切片1次，室温，10-15分钟；所述的H₂O₂终浓度为2% ，所述的0.1mol/L DEPC-PB:是用磷酸氢二钠29.0克，磷酸二氢钠2.9克，用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1%的DEPC 1ml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；

2）用摩尔浓度为0.1 mol/L的 DEPC-PB孵育步骤1）中处理过的切片1次，室温，10-20 分钟；

3）用含有Triton X-100终浓度为0.3%的摩尔浓度为0.1 mol/L的 DEPC-PB孵育步骤2）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的Triton X-100 终浓度为0.3%；

4）50 ml的乙酰化液孵育步骤3）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；

5）摩尔浓度为0.1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4）中处理过的切片2次，室温，各10 -15分钟；

6）在杂交液中孵育步骤5）中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60℃，所需时间1-2小时； 

7）在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和FITC标记的探针的终浓度为1ug/ml, 杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火温度来确定；

8）从步骤7）所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60 ℃，各20-30分钟；

9）用RNA缓冲液孵育步骤8）中处理过的切片1次，37℃，20-30分钟；

10）用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9）中处理过的切片，37℃，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml；

11）用2 X SSC孵育步骤10) 中处理过的切片2次， 37℃，各20-30分钟；

12）用0.2x SSC孵育步骤11）中处理过的切片2次， 37℃，各20-30分钟；

13）用TS7.5孵育步骤12）中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7.5是由摩尔浓度为0.1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5, 摩尔浓度为 0.15 mol /L NaCl溶液用超纯水配制而成；

14）用TBS封闭将步骤13）中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS: 是由TS7.5和体积百分比为1%的Blocking Reagent配制而成；