[发明专利]一种荧光原位双杂交方法

权利要求书

1.一种荧光原位双杂交方法，其特征是：它包括以下具体步骤是： 

1）用含有H₂O₂终浓度为2%的摩尔浓度为0.1 mol/L的 DEPC-PB 孵育切片1次，室温，10-15分钟；所述的H₂O₂终浓度为2% ，所述的0.1mol/L DEPC-PB:是用磷酸氢二钠29.0克，磷酸二氢钠2.9克，用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1%的DEPC 1ml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；

2）用摩尔浓度为0.1 mol/L的 DEPC-PB孵育步骤1）中处理过的切片1次，室温，10-20 分钟；

3）用含有Triton X-100终浓度为0.3%的摩尔浓度为0.1 mol/L的 DEPC-PB孵育步骤2）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的Triton X-100 终浓度为0.3%；

4）50 ml的乙酰化液孵育步骤3）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；

5）摩尔浓度为0.1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4）中处理过的切片2次，室温，各10 -15分钟；

6）在杂交液中孵育步骤5）中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60℃，所需时间1-2小时； 

7）在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和FITC标记的探针的终浓度为1ug/ml, 杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火温度来确定；

8）从步骤7）所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60 ℃，各20-30分钟；

9）用RNA缓冲液孵育步骤8）中处理过的切片1次，37℃，20-30分钟；

10）用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9）中处理过的切片，37℃，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml；

11）用2 X SSC孵育步骤10) 中处理过的切片2次， 37℃，各20-30分钟；

12）用0.2x SSC孵育步骤11）中处理过的切片2次， 37℃，各20-30分钟；

13）用TS7.5孵育步骤12）中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7.5是由摩尔浓度为0.1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5, 摩尔浓度为 0.15  mol /L NaCl溶液用超纯水配制而成；

14）用TBS封闭将步骤13）中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS: 是由TS7.5和体积百分比为1%的Blocking Reagent配制而成； 

15）按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤14）中处理过的切片，室温，过夜；　

16）用TNT于室温洗涤步骤15）中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟； 所述的TNT: 是由 TS7.5和体积百分比为0.05% Tween20配制而成；  

17）用摩尔浓度为0.1 mol/L 的PB洗涤步骤16）中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；

18）TSA-Biotin 反应，放大杂交信号：

　　　                                                将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10-15分钟；

　　　在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/ml ?-D葡萄糖，于室温孵育30分钟；

19）用0.1 mol /L 的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10-20分钟；

20）在NaN₃的终浓度为2%的0.1 mol/L的 PB中孵育步骤19) 处理过的切片，室温，10-15分钟；

21）用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；

22）按1:2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21)中处理过的切片，过夜； 

23）用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；

24） TSA-DNP反应：根据试剂盒的说明书操作，按照1：50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片； 

25）用TNT洗涤步骤24)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；

26）用TNT按照2种荧光抗体：Alexa488-DNP和Streptavidin - Cy3的效价1：200同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片2-4小时；

27）用TNT洗涤步骤26)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；

28）将步骤27)中处理过的切片表片，封片。