[发明专利]一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法

摘要

本发明一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，特点是具体包括将乳酸乳球菌乳亚种菌株发酵剂接种培养，然后对发酵液进行超滤浓缩、沉淀、乙醇提取，再离心取沉淀物冷冻干燥，得粉末状的乳酸菌胞外粗多糖的步骤；依次经过DEAE-纤维素离子交换柱分离纯化和SepharoseCL-6B凝胶柱层析分离纯化，再经脱盐、超滤浓缩、乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷冻干燥，得到乳酸菌胞外纯多糖的步骤；最后乳酸菌胞外纯多糖的磷酸化加热磷酸化和硒酸化的步骤，优点是用干燥加热的方法，对乳酸乳球菌乳亚种菌株产的胞外多糖进行硒化和磷酸化修饰，获得具有显著抗氧化和免疫增强效应的功能性乳酸乳球菌胞外多糖。

主权项

一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：（1）乳酸菌胞外粗多糖的制备将乳酸乳球菌乳亚种菌株发酵剂按体积百分比3.0‑5.0%的接种量，接种在改进的BLX培养基上，先在37℃下培养20 h，再在28‑32℃下培养10‑15h，6000‑7000rpm离心15‑20min除去菌体细胞得含胞外多糖的发酵液，然后对发酵液进行超滤浓缩，再按浓缩液质量的10%的加入三氯醋酸沉淀，0‑4oC下放置8‑12小时，然后6000‑7000rpm离心15‑20min，取上清液进行超滤浓缩，得粗多糖浓缩液，再加入体积为粗多糖浓缩液3倍的90‑95%的乙醇溶液，在4℃静置10‑12小时，然后6000‑7000rpm离心20‑25min，取沉淀物冷冻干燥，得粉末状的乳酸菌胞外粗多糖；（2）乳酸菌胞外粗多糖的分离纯化将步骤（1）获得的乳酸菌胞外粗多糖溶解于少量蒸馏水中，先经DEAE‑纤维素离子交换柱分离纯化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第一洗脱峰的洗脱液，冷冻浓缩至5‑6mL后，再经Sepharose CL‑6B凝胶柱层析分离纯化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第二洗脱峰的洗脱液，将洗脱液经截留分子量为280‑320道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐，再经超滤浓缩，90‑95%的乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷冻干燥，得到乳酸菌胞外纯多糖；（3）乳酸菌胞外纯多糖的磷酸化将步骤（2）得到的乳酸菌胞外纯多糖与磷酸盐溶液按质量比6:1～3的比例混匀，并调节pH至4.0‑6.0, 冷冻干燥，至粉末状，然后移至干燥箱内，在70‑90℃下加热反应4‑6h，然后用70‑75%的乙醇溶液冲洗除去多余的盐类，再置于旋转蒸发器中蒸馏2‑3小时，除去残留的乙醇，真空冷冻干燥，获得固体磷酸化多糖 ，其中磷酸根接枝量达到1.64‑1.70 mg/g；（4）硒酸化将步骤（3）获得的固体磷酸化多糖溶于水中得到质量百分比为15%的磷酸化多糖溶液，将磷酸化多糖溶液与硒化剂按质量比9:1的比例混匀，并调节pH至1.5‑2.5， 冷冻干燥至粉末状，然后移至干燥箱内，在45‑55℃下加热反应12‑15h，然后用70‑75%的乙醇溶液冲洗除去多余的硒化剂，再置于旋转蒸发器中蒸馏，除去残留的乙醇，放入透析袋内，置于蒸馏水中透析除去残留的硒化剂，透析结束后，将透析袋内的多糖溶液到入烧杯，加入3倍多糖溶液体积的90‑95%乙醇沉淀，4℃静置10‑12小时，6000‑7000rpm离心20‑25min，取沉淀物冷冻干燥，即得磷酸化及硒酸化多糖产物即功能性乳酸菌胞外多糖，其中硒的含量为0.17‑0.18 mg/g。