[发明专利]一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物胞外多糖，尤其是涉及一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法。 

背景技术

近几十年来, 由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特殊优势而得到大力研究和开发, 微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液多糖或荚膜多糖, 它们具有增稠、乳化、保湿和稳定等作用，有助于改善发酵乳制品的流变学特性，减少乳清析出现象，改善发酵乳质地和感官质量，一些乳酸菌胞外多糖还具有调节机体免疫力、抗肿瘤等作用。由于乳酸菌是食品级工业生产菌, 与其他菌相比安全性高, 所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多,特别是它在发酵乳制品中的的作用一直是国内外学者研究开发的热点之一。但由于其产量和功能活性较低, 是制约其大规模生产的主要因素一。

研究发现, 多糖的活性直接或间接地受其分子结构的影响，采取一定的方法对多糖分子结构进行修饰，可以提高或赋予多糖更多活性、降低其毒副作用。目前对多糖进行修饰的常见方法有硫酸化、羧甲基化、乙酰化、烷基化、磺酰化等，许多天然多糖经硫酸化修饰后的生物活性增强，尤其是抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病、对机体的免疫功能方面显著增强，因而受到极大关注。

近年来，多糖的硒化修饰也开始引起人们的关注，研究者对植物或微生物进行富硒栽培或培养，通过它们的生长代谢，对硒进行富集和生物转化，或通过多糖硒化修饰，将硒或含硒的功能基团接枝到多糖分子上，以获得活性更强的硒多糖。研究证明，硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒，更易于被机体吸收和利用，如通过富硒培养获得的灵芝硒多糖比灵芝多糖有更显著的抑制肿瘤生长的活性。但是乳酸菌胞外多糖的富硒载培或培养所得硒多糖，存在硒含量不高等不足，而现有多糖的硒化修饰技术，常使用大量的有机溶剂，产品既不安全又容易污染环境，而且存在硒结构相对单一等缺点。

磷酸化修饰是一种共价修饰，是支链上的羟基被磷酸根取代的过程。磷酸化多糖可使一些原本不具有活性的多糖显示了抗肿瘤等生理活性。但是目前关于磷酸化修饰主要集中在淀粉、壳聚糖和纤维素等，乳酸菌胞外多糖磷酸化修饰方面的研究至今未见有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时对乳酸乳球菌乳亚种菌株产的胞外多糖进行硒化和磷酸化修饰，使硒含量充足并且安全环保的功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，该功能性乳酸菌胞外多糖具有显著抗氧化和免疫增强效应。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）乳酸菌胞外粗多糖的制备

将乳酸乳球菌乳亚种菌株发酵剂按体积百分比3.0-5.0%的接种量，接种在改进的BLX培养基上，先在37℃下培养20 h，再在28-32℃下培养10-15h，6000-7000rpm离心15-20min除去菌体细胞得含胞外多糖的发酵液，然后对发酵液进行超滤浓缩，再按浓缩液质量的10%的加入三氯醋酸沉淀，0-4^oC下放置8-12小时，然后6000-7000rpm离心15-20min，取上清液进行超滤浓缩，得粗多糖浓缩液，再加入体积为粗多糖浓缩液3倍的90-95%的乙醇溶液，在4℃静置10-12小时，然后6000-7000rpm离心20-25min，取沉淀物冷冻干燥，得粉末状的乳酸菌胞外粗多糖；

（2）乳酸菌胞外粗多糖的分离纯化

将步骤（1）获得的乳酸菌胞外粗多糖溶解于少量蒸馏水中，先经DEAE-纤维素离子交换柱分离纯化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第一洗脱峰的洗脱液，冷冻浓缩至5-6mL后，再经Sepharose CL-6B凝胶柱层析分离纯化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第二洗脱峰的洗脱液，将洗脱液经截留分子量为280-320道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐，再经超滤浓缩，90-95%的乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷冻干燥，得到乳酸菌胞外纯多糖；

（3）乳酸菌胞外纯多糖的磷酸化

将步骤（2）得到的乳酸菌胞外纯多糖与磷酸盐溶液按质量比6:1～3的比例混匀，并调节pH至4.0-6.0, 冷冻干燥至粉末状，然后移至干燥箱内，在70-90℃下加热反应4-6h，然后用70-75%的乙醇溶液冲洗除去多余的盐类，再置于旋转蒸发器中蒸馏2-3小时，除去残留的乙醇，真空冷冻干燥，获得固体磷酸化多糖 ，其中磷酸根接枝量达到1.64-1.70 mg/g；

（4）硒酸化