[发明专利]一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法

权利要求书

1.一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）乳酸菌胞外粗多糖的制备

将乳酸乳球菌乳亚种菌株发酵剂按体积百分比3.0-5.0%的接种量，接种在改进的BLX培养基上，先在37℃下培养20 h，再在28-32℃下培养10-15h，6000-7000rpm离心15-20min除去菌体细胞得含胞外多糖的发酵液，然后对发酵液进行超滤浓缩，再按浓缩液质量的10%的加入三氯醋酸沉淀，0-4^oC下放置8-12小时，然后6000-7000rpm离心15-20min，取上清液进行超滤浓缩，得粗多糖浓缩液，再加入体积为粗多糖浓缩液3倍的90-95%的乙醇溶液，在4℃静置10-12小时，然后6000-7000rpm离心20-25min，取沉淀物冷冻干燥，得粉末状的乳酸菌胞外粗多糖；

（2）乳酸菌胞外粗多糖的分离纯化

将步骤（1）获得的乳酸菌胞外粗多糖溶解于少量蒸馏水中，先经DEAE-纤维素离子交换柱分离纯化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第一洗脱峰的洗脱液，冷冻浓缩至5-6mL后，再经Sepharose CL-6B凝胶柱层析分离纯化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第二洗脱峰的洗脱液，将洗脱液经截留分子量为280-320道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐，再经超滤浓缩，90-95%的乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷冻干燥，得到乳酸菌胞外纯多糖；

（3）乳酸菌胞外纯多糖的磷酸化

将步骤（2）得到的乳酸菌胞外纯多糖与磷酸盐溶液按质量比6:1～3的比例混匀，并调节pH至4.0-6.0, 冷冻干燥，至粉末状，然后移至干燥箱内，在70-90℃下加热反应4-6h，然后用70-75%的乙醇溶液冲洗除去多余的盐类，再置于旋转蒸发器中蒸馏2-3小时，除去残留的乙醇，真空冷冻干燥，获得固体磷酸化多糖 ，其中磷酸根接枝量达到1.64-1.70 mg/g；

（4）硒酸化

将步骤（3）获得的固体磷酸化多糖溶于水中得到质量百分比为15%的磷酸化多糖溶液，将磷酸化多糖溶液与硒化剂按质量比9:1的比例混匀，并调节pH至1.5-2.5， 冷冻干燥至粉末状，然后移至干燥箱内，在45-55℃下加热反应12-15h，然后用70-75%的乙醇溶液冲洗除去多余的硒化剂，再置于旋转蒸发器中蒸馏，除去残留的乙醇，放入透析袋内，置于蒸馏水中透析除去残留的硒化剂，透析结束后，将透析袋内的多糖溶液到入烧杯，加入3倍多糖溶液体积的90-95%乙醇沉淀，4℃静置10-12小时，6000-7000rpm离心20-25min，取沉淀物冷冻干燥，即得磷酸化及硒酸化多糖产物即功能性乳酸菌胞外多糖，其中硒的含量为0.17-0.18 mg/g。

2.根据权利要求1所述的一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：

所述的乳酸乳球菌乳亚种菌株发酵剂的活菌数含量达到10^5-7个/mL。

3.根据权利要求1所述的一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于所述的改进BLX培养基，其组成如下：1.5-2.0%葡萄糖，1.0-1.2%果糖，1.3-1.5%大豆蛋白胨，1.3-1.5%胰蛋白胨，初始pH为6.0-6.5。

4.根据权利要求1所述的一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于步骤（1）和步骤（2）中所述的超滤浓缩过程为：采用装有孔径为50千道尔顿内压式中空纤维膜，在操作压力为0.25-0.40MPa，操作温度为20-25℃的条件下，对乳酸乳球菌乳亚种发酵液中胞外多糖进行超滤浓缩。

5.根据权利要求1所述的一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的磷酸盐溶液为磷酸盐与水按质量比20:1的比例混合而成。

6.根据权利要求5所述的一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的磷酸盐为六偏磷酸钠（Na₆P₆O₁₈）、三聚磷酸钠(Na₅P₃O₁₀)和焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)中的任一种。

7.根据权利要求1所述的一种功能性乳酸菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的硒化剂指乙酸硒醚或亚硒酸钠或二者混合物。