[发明专利]与抗病毒免疫相关的猪ISG60基因的TPR结构基序和细胞定位

摘要

本发明提供了与抗病毒免疫相关的猪ISG60基因的TPR(tetratricopeptide repeat)结构基序，ISG60基因的TPR结构基序含有病毒感染相关的调控元件序列，与现有报道的猪基因的TPR结构没有显著同源性。本发明还具体地涉及到猪ISG60基因的策略，鉴定了ISG60基因在细胞中的定位，通过ISG60基因的TPR结构基序，能够用于研究猪瘟病毒感染机制，并通过揭示该基因抗猪瘟病毒的机制，开发一种治疗猪瘟的药物。

主权项

一种与抗病毒免疫相关的猪ISG60基因的TPR结构基序和细胞定位，其特征在于：包括以下的步骤：(1)基因在染色体上的定位；(2)基因片段的获得；(3)载体构建；(4)基因在细胞上的定位；(5)TPR结构基序的获得；所述的基因在染色体上的定位，首先是采用猪全基因组芯片分析猪外周血淋巴细胞的基因表达谱，发现ISG60基因在猪瘟病毒感染后表达量增多，在感染后6天该基因的表达量最多，通过将ISG60基因的EST序列与NCBI数据库中公布的猪基因组序列进行比对，发现ISG60基因定位于猪14号染色体上；所述的基因片段的获得，首先是采用重组人I型干扰素IFN‑α2b刺激猪肾上皮细胞PK‑15细胞系介导产生ISG60基因，Trizol抽提诱导后的PK‑15的总RNA，用寡聚核苷酸oligo dT16作为反转录的引物将总RNA反转录为cDNA；根据猪全基因组芯片上的ISG605’端的表达序列标签(EST)序列，设计针对ISG60基因的特异性引物，用特异性引物PCR扩增ISG60基因，并克隆至pMD18‑T载体上，测序鉴定，确定获得了ISG60的基因片段；所述载体构建是将编码6×His的核苷酸标记的ISG60基因，亚克隆至pCDNA3.0真核载体上，将构建好的真核表达载体转染PK‑15细胞；所述基因在细胞上的定位，首先是用重组真核表达载体转染PK‑15细胞，然后采用间接免疫荧光技术观察ISG60基因在PK‑15细胞上的定位；所述TPR结构基序的获得是将克隆的猪ISG60基因测序鉴定后，得到包括完整ORF的核苷酸序列，并推导出了相应的氨基酸序列，按已知TPR基序预测方法，对ISG60基因的推导氨基酸序列进行TPR基序预测，预测发现，ISG60基因含7个TPR结构基序。