[发明专利]一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用

摘要

本发明介绍了一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用，使用Taq酶1U、Taq酶自带10×PCRBuffer2.5μl、Taq酶自带25mmol·L-1Mg2＋盐3.0μl、10mmol·L-1mixdNTP0.5μl、 10pmol·µl-1犬的巴贝西虫特异性PCR上下游引物各0.5μl、待测DNA样品4.0μl，加水至25.0μl，95℃预变性5min，变性、退火、延伸进行35个循环，72℃延伸7min，冷却结束反应。本方法检测速度快，2小时可得结果，样品稀释1000倍仍能检测，选择性强不与其他DNA反应。

主权项

一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是包括下述步骤：（1）样品DNA抽提首先于待检犬前肢隐静脉取300μl抗凝血，之后提取DNA，获得DNA即可作为PCR检测的DNA样品；（2）样品检测犬的巴贝西虫PCR的诊断方法如下：其反应体系为25μl ，即Taq酶即热稳定性的DNA 聚合酶1 U、Taq酶自带10×PCR Buffer 2.5 μl、Taq酶自带25 mmol· L‑1 Mg2＋盐3.0 μl、10 mmol·L‑1 mix dNTP即三磷酸脱氧核糖核苷0.5 μl、 10pmol·µl‑1本发明提供的一对犬巴贝西虫特异性PCR引物的上下游引物各0.5 μl、待测犬全血DNA样品4.0 μl，加纯水至25.0 μl；反应程序为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，将变性、退火、延伸三个过程 进行35个循环，最后再72 ℃延伸7 min，之后冷却至4℃，PCR反应结束；所述的一对犬的巴贝西虫特异性PCR引物，其上游引物F1核苷酸序列为GTAATTCCAGCTCCAATA，下游引物F2核苷酸序列为 TTTCGCAGTAGTTCGTC；（3）结果判定反应结束后取5 μl PCR产物在2.0 %EB（溴化乙锭）染色的琼脂糖凝胶上电泳；电泳后，紫外灯下观察结果，出现大小约为319bp的片段的样品为阳性结果，即为巴贝西虫感染犬。