[发明专利]一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用

权利要求书

1.一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是包括下述步骤：

（1）样品DNA抽提

首先于待检犬前肢隐静脉取300μl抗凝血，之后提取DNA，获得DNA即可作为PCR检测的DNA样品；

（2）样品检测

犬的巴贝西虫PCR的诊断方法如下：其反应体系为25μl ，即Taq酶即热稳定性的DNA 聚合酶1 U、Taq酶自带10×PCR Buffer 2.5 μl、Taq酶自带25 mmol· L^-1 Mg^2＋盐3.0 μl、10 mmol·L^-1 mix dNTP即三磷酸脱氧核糖核苷0.5 μl、 10pmol·μl^-1本发明提供的一对犬巴贝西虫特异性PCR引物的上下游引物各0.5 μl、待测犬全血DNA样品4.0 μl，加纯水至25.0 μl；反应程序为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，将变性、退火、延伸三个过程 进行35个循环，最后再72 ℃延伸7 min，之后冷却至4℃，PCR反应结束；所述的一对犬的巴贝西虫特异性PCR引物，其上游引物F1核苷酸序列为GTAATTCCAGCTCCAATA，下游引物F2核苷酸序列为 TTTCGCAGTAGTTCGTC；

（3）结果判定

反应结束后取5 μl PCR产物在2.0 %EB（溴化乙锭）染色的琼脂糖凝胶上电泳；电泳后，紫外灯下观察结果，出现大小约为319bp的片段的样品为阳性结果，即为巴贝西虫感染犬。

2.根据权利要求1所述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是：提取DNA的方法为使用市售全血DNA提取试剂盒按说明书进行操作进行提取。

3.根据权利要求1所述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是：抗凝血提取DNA使用市售全血DNA提取试剂盒按说明书进行操作，具体使用TAKARA公司全血DNA提取试剂盒，步骤如下：

（1）、按处理样品数准备1.5 ml离心管，并各加入GenTLE SolutionⅠ500 μl；

把混合均匀的100 μl血液，加入到分装好的GenTLE SolutionⅠ的离心管中，立即震荡3~15秒钟；

（2）、室温放置10分钟以上，然后在室温条件下12,000 rpm以上离心5分钟；

（3）、用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管微车的内壁上，除去溶液时，枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，不要吸走沉淀物；

（4）、加入1 ml的GenTLE SolutionⅡ；此时GenTLE SolutionⅡ应沿着理性管内侧壁加入大离心管中；

（5）、轻柔地上下颠倒离心管2~10次，室温12,000 rpm以上离心2分钟，用移液枪小心地除去上清溶液；

（6）、向离心管中加入GenTLE SolutionⅢ 500 μl，轻微震荡10秒充分混合；

室温12,000 rpm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管中；

（7）、加入等体积（500 μl）的异丙醇，上下轻柔颠倒2~10次，均匀混合；

（8）、4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液；

（9）、加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液；

（10）、干燥沉淀；离心管中没有乙醇气味即可；

（11）、用10-50μl的TE缓冲液（10mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液），1mM EDTA （乙二胺四乙酸），pH=8.0）溶解沉淀。

4.一种权利要求1所述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法在检测犬巴贝西虫上的应用。