[发明专利]一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用

说明书

 

技术领域

     本发明涉及一种生物工程技术，特别是一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用，基于巴贝西虫18s RNA基因序列设计合成的1对特异性诊断引物，同时公开了PCR诊断方法的操作。

背景技术

巴贝西虫病是广泛发生于各种家畜，经蜱传播的一种血源性原虫病。其在家畜体内单个或成对寄生于红细胞内，引起严重的贫血和血红蛋白尿症。引起犬的巴贝西虫病的病原体有3 种，即犬巴贝西虫(Babeisa canis)、韦氏巴贝西虫（B. vitlli）和吉氏巴贝西虫（B. gibsoni）。犬巴贝西虫分布于欧洲、美洲和印度，韦氏巴贝西虫分布于南美洲，吉氏巴贝西虫分布于亚洲。我国主要流行的虫种为吉氏巴贝西虫，该病在国内广泛分布，有蜱滋生的地方，春、夏、秋季均可发病，故对这类疾病应当有一定的认识。

目前，血液原虫诊断方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫反应、间接荧光、多聚酶链式反应（PCR）等。涂片染色镜检法虽然设备简单、操作简便，但是检测率低。在检测隐性带虫感染时则易出现假阴性。血清学诊断法不能区别是现在感染还是过去感染。而PCR技术以其较高的特异性和敏感性被学者认为是检测巴贝西虫的最有效方法。因此建立行之有效的巴贝西虫检测方法，进而为诊断和治疗犬巴贝西虫病提供良好的基础，对巴贝西虫的防控工作有着积极的作用。

本发明利用PCR技术，提供了一对特异性引物，扩增出包含犬的巴贝西虫18s RNA基因差异序列的片段，并在此基础上建立了诊断方法，该方法可在犬的巴贝西虫的诊断和流行病学调查中发挥一定作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用，针对现有诊断巴贝西虫方法的不足，提供一种能够快速，特异性的诊断方法；基于巴贝西虫18s RNA基因序列设计合成的1对特异性诊断引物，同时公开了PCR诊断方法的操作。

为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，包括下述步骤：

（1）样品DNA抽提

首先于待检犬前肢隐静脉取300μl抗凝血，之后提取DNA，获得DNA即可作为PCR检测的DNA样品；

（2）样品检测

犬的巴贝西虫PCR的诊断方法如下：其反应体系为25μl ，即Taq酶即热稳定性的DNA 聚合酶1 U、Taq酶自带10×PCR Buffer 2.5 μl、Taq酶自带25 mmol· L^-1 Mg^2＋盐3.0 μl、10 mmol·L^-1 mix dNTP即三磷酸脱氧核糖核苷0.5 μl、 10pmol·μl^-1本发明提供的一对犬巴贝西虫特异性PCR引物的上下游引物各0.5 μl、待测犬全血DNA样品4.0 μl，加纯水至25.0 μl；反应程序为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，将变性、退火、延伸三个过程 进行35个循环，最后再72 ℃延伸7 min，之后冷却至4℃，PCR反应结束；所述的一对犬的巴贝西虫特异性PCR引物，其上游引物F1核苷酸序列为GTAATTCCAGCTCCAATA，下游引物F2核苷酸序列为 TTTCGCAGTAGTTCGTC；

（3）结果判定

反应结束后取5 μl PCR产物在2.0 %EB（溴化乙锭）染色的琼脂糖凝胶上电泳；电泳后，紫外灯下观察结果，出现大小约为319bp的片段的样品为阳性结果，即为巴贝西虫感染犬。

提取DNA的方法可以为使用市售全血DNA提取试剂盒按说明书进行操作提取，以TAKARA公司全血DNA提取试剂盒为例，步骤如下：

（1）、按处理样品数准备1.5 ml离心管，并各加入GenTLE SolutionⅠ500 μl。

把混合均匀的100 μl血液，加入到分装好的GenTLE SolutionⅠ的离心管中，立即震荡数秒钟，例如3~15秒；

（2）、室温放置10分钟以上，然后在室温条件下12,000 rpm以上离心5分钟；

（3）、用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管微车的内壁上，除去溶液时，枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，不要吸走沉淀物；

（4）、加入1 ml的GenTLE SolutionⅡ；此时GenTLE SolutionⅡ应沿着理性管内侧壁加入大离心管中；