[发明专利]一种田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种基于免培养和PCR扩增技术的田间烟草赤星病菌对二甲酰亚胺类、吡咯苯类和芳香烃类三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，属于植物病理学和分子生物学领域。本发明通过提取烟草赤星病病斑组织块中的烟草赤星病菌基因组DNA，并以基因组DNA为模板，应用特异性引物快速扩增双组分组氨酸激酶N端六组92个氨基酸重复区。通过基因序列比对确定烟草赤星病菌对二甲酰亚胺类、吡咯苯类和芳香烃类杀菌剂是否产生抗药性。本发明具有快捷、简便和准确等优点，在烟草赤星病菌抗性监测上具有良好的应用前景。

主权项

1.一种田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：（1）根据GenBank上发表的烟草赤星病菌双组分组氨酸激酶编码序列，应用引物设计软件，设计如下特异性引物：HKFwd1:5’-AGGCTGACAGACAACAGACAA-3’；HKRev1:5’-CGAGCGTAAGTTGGGTCAT-3’；HKFwd2:5’-CAGCCATCATCCGCAACC-3’；HKRev2:5’-AGACAGGGCGTCGTCATA-3’；（2）从连续3年以上使用农药防治田间烟草赤星病菌的烟地采集有典型烟草赤星病病斑特征的烟叶，从烟叶上剪切下病斑组织块，放入研钵中用液氮速冻并研成粉末状，用真菌DNA提取试剂盒提取病斑组织块中烟草赤星病菌基因组DNA；（3）将提取的基因组DNA用灭菌去离子水稀释，以基因组DNA为模板，采用步骤（1）中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对双组分组氨酸激酶的N端六组92个氨基酸重复区进行PCR扩增，电泳检测，纯化1500-2000bp或3000-3500bp长度范围内的扩增片段；（4）将扩增片段连接到测序载体pMD18-T或pCR2.1中，42℃水浴热击1.5min-4min后，将连接产物转入大肠杆菌DH5α细胞中，通过氨苄青霉素抗性平板筛选，以平板上长出的菌落为模板，进行菌落PCR扩增，电泳检测，PCR扩增引物、扩增体系和扩增反应程序与步骤（3）相同，通过电泳结果判断含有目的条带的菌落是阳性转化子，对阳性转化子进行测序；（5）利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLASTN对每个转化子测序序列进行分析，判断测序序列是否是双组分组氨酸激酶的N端六组92个氨基酸重复区序列后，将测序的DNA序列翻译成氨基酸序列，并将这些氨基酸序列与烟草赤星病敏感菌株的氨基酸序列进行比对分析，确定转化子双组分组氨酸激酶的N端六组92个氨基酸重复区是否存在突变，并统计含突变序列的转化子占总的测序转化子的比例，根据比例判断烟草赤星病菌抗药性情况。