[发明专利]一种田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法

权利要求书

1.一种田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：

（1）根据GenBank上发表的烟草赤星病菌双组分组氨酸激酶编码序列，应用引物设计软件，设计如下特异性引物：

HKFwd1: 5’-AGGCTGACAGACAACAGACAA-3’；

HKRev1: 5’-CGAGCGTAAGTTGGGTCAT-3’；

HKFwd2: 5’-CAGCCATCATCCGCAACC-3’；

 HKRev2: 5’-AGACAGGGCGTCGTCATA-3’；

（2）从连续3年以上使用农药防治田间烟草赤星病菌的烟地采集有典型烟草赤星病病斑特征的烟叶，从烟叶上剪切下病斑组织块，放入研钵中用液氮速冻并研成粉末状，用真菌DNA提取试剂盒提取病斑组织块中烟草赤星病菌基因组DNA；

（3）将提取的基因组DNA用灭菌去离子水稀释，以基因组DNA为模板，采用步骤（1）中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对双组分组氨酸激酶的N端六组92个氨基酸重复区进行PCR扩增，电泳检测，纯化1500-2000bp或3000-3500bp长度范围内的扩增片段；

（4）将扩增片段连接到测序载体pMD18-T或pCR^?2.1中，42℃水浴热击1.5min-4min后，将连接产物转入大肠杆菌DH5α细胞中，通过氨苄青霉素抗性平板筛选，以平板上长出的菌落为模板，进行菌落PCR扩增，电泳检测，PCR扩增引物、扩增体系和扩增反应程序与步骤（3）相同，通过电泳结果判断含有目的条带的菌落是阳性转化子，对阳性转化子进行测序；

（5）利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLAST N对每个转化子测序序列进行分析，判断测序序列是否是双组分组氨酸激酶的N端六组92个氨基酸重复区序列后，将测序的DNA序列翻译成氨基酸序列，并将这些氨基酸序列与烟草赤星病敏感菌株的氨基酸序列进行比对分析，确定转化子双组分组氨酸激酶的N端六组92个氨基酸重复区是否存在突变，并统计含突变序列的转化子占总的测序转化子的比例，根据比例判断烟草赤星病菌抗药性情况。

2.根据权利要求1所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于采用特异引物HKFwd1和HKRev1扩增时时，PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2.5min，35个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；采用特异引物HKFwd2和HKRev2扩增时，PCR反应程序为：94预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸4min，35个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。

3.根据权利要求1或2所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于PCR反应体系为：扩增反应的总体积为50μl，其中基因组DNA 1 μl，10 × LA PCR buffer II 5 μl，25 mmol/L MgCl₂ 3 μl，10μmol/L dNTP 1 μl，10 μmol/L引物各1 μl，5 units/μl Takara LA Taq0.5 μl，灭菌水37.5 μl。

4.根据权利要求1、2或3所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于剪切下的病斑组织块边长为0.5-1.0cm，每亩烟地随机取3-5个病斑组织块。

5.根据权利要求1、2或3所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于提取的基因组DNA稀释后浓度为10-50ng/μl。

6.根据权利要求1、2或3所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于42℃水浴热击时间优选3min。

7.根据权利要求1、2或3所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于每亩烟地随即选取的阳性转化子数为80-120个。

8.根据权利要求1、2或3所述的田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，其特征在于转化子突变比例在1%-5%时，烟地中烟草赤星病菌刚产生抗药性，有引起抗药性流行的趋势；比例大于5%时，烟地中烟草赤星病菌抗药性已经流行。