[发明专利]一种田间烟草赤星病菌对三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于免培养和PCR扩增技术的田间烟草赤星病菌对二甲酰亚胺类、吡咯苯类和芳香烃类三类杀菌剂抗药性的快速鉴定方法，属于植物病理学和分子生物学领域。

背景技术

由长柄链格孢（Alternaria longipes）侵染引起的田间烟草赤星病是一种重要的烟草真菌病害。二甲酰亚胺类（Dicarboximide）、吡咯苯类（Phenylpyrrole）和芳香烃类（Aromatic hydrocarbon）杀菌剂因具有杀菌谱广，防治效果显著等特点，被广泛应用于多个类群植物病原真菌的防治。然而，随着这三类杀菌剂使用时间的延长、施用量的加大，很多植物病原真菌（包括A. longipes）对该三类杀菌剂出现了严重的交互抗药性问题，给植物真菌病害的化学防治带来了巨大挑战，造成了重大经济损失。

目前，检测田间烟草赤星病菌抗药性的传统方法是：1）从烟草叶上剪下含典型烟草赤星病病斑特征的组织块，经消毒后，在普通马铃薯琼脂培养基（Potato dextrose agar, PDA）上培养；2）单孢分离烟草赤星病菌；3）在含药平板上，对单孢分离的菌株进行抗药性水平检测。这种方法耗时耗力，例如，按一个组织块分离100个单孢子计算，最终获得每个单孢菌株的抗药性水平最少需要1个月，并且用该种方法得到的结果并不能完全准确的反应田间烟草赤星病菌的抗药性情况，因为当田间抗药性菌株刚刚出现但还没成为优势菌群时，由于在PDA培养基平板上抗药性菌株比敏感菌株具有较弱的生长竞争力，最后获得的单孢菌株可能全部都是敏感菌株，得到“田间没有抗药性菌株产生”的结论，影响药物防治策略，最终使防治失效，造成严重经济损失。

植物病原真菌抗药性的分子机理研究发现，双组分组氨酸激酶TCHK（Two-component histidine kinase, TCHK）的N端六组92个AARD（Amino acid repeat domain, AARD）内存在各种各样的突变（点突变，缺失和插入等）是导致它们对上述三类杀菌剂产生抗药性的原因。检测TCHK的N端六组92个AARD是否存在突变，就能了解田间烟草赤星病菌对该三类农药是否产生了抗药性以及抗药性是否有流行的趋势，指导杀菌剂的合理使用，克服或延缓抗药性产生，以及更好地研究开发新型杀菌剂。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，通过免培养和PCR扩增技术，提供了一种快速鉴定田间烟草赤星病菌对二甲酰亚胺类、吡咯苯类和芳香烃类杀菌剂产生抗药性的方法。

本发明通过以下技术方案予以实现：

（1）根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上发表的烟草赤星病菌TCHK编码序列，设计如下特异性引物：

HKFwd1: 5’-AGGCTGACAGACAACAGACAA-3’；

HKRev1: 5’-CGAGCGTAAGTTGGGTCAT-3’；

HKFwd2: 5’-CAGCCATCATCCGCAACC-3’；

HKRev2: 5’-AGACAGGGCGTCGTCATA-3’；

（2）从连续3年以上使用农药防治田间烟草赤星病菌的烟地采集有典型烟草赤星病病斑特征的烟叶，从烟叶上剪切下病斑组织块，放入研钵中用液氮速冻并研成粉末状，用真菌DNA提取试剂盒提取病斑组织块中烟草赤星病菌基因组DNA；

（3）将提取的基因组DNA用灭菌去离子水稀释，以基因组DNA为模板，采用步骤（1）中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对TCHK的N端六组92个AARD进行PCR扩增，电泳检测，纯化1500-2000bp或3000-3500bp长度范围内的扩增片段；

（4）将扩增片段连接到商业化的测序载体（pMD18-T或pCR^?2.1）中，42℃水浴热击1.5min-4min后，将连接产物转入大肠杆菌DH5α细胞中，通过氨苄青霉素抗性平板筛选，以平板上长出的菌落为模板，进行菌落PCR扩增，电泳检测，PCR扩增引物、扩增体系和扩增反应程序与步骤（3）相同，通过电泳结果判断含有目的条带（1500-2000bp或3000-3500bp）的菌落是阳性转化子，将阳性转化子送到专业的测序公司（如上海生工、北京三博等），测序；