[发明专利]表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法

摘要

表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，属于基因工程。步骤有：将NTN和TH基因分别插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点，用筛选出的模板和引物PCR扩增得到双顺反子表达盒，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV转录和翻译，电转感受态细胞BJ-5183，筛选阳性克隆，经鉴定转化XL-10(Gold)宿主菌,在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。本发明重组腺病毒Ad-NTN-TH感染宿主细胞后能稳定转录和共表达NTN和TH，表达的功能蛋白NTN在体外促进鸡胚背根神经节生长突触，还能促进胎鼠多巴胺能神经元的存活，酪氨酸羟化酶TH在体外催化L-Tyrosine反应生成L-DOPA。

主权项

表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）首先利用EcoRV和Xhol酶切位点将NTN基因插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点B中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA‑NTN，再通过BamHI和EcoRI酶切位点将TH基因插入该质粒多克隆位点A中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA‑NTN‑TH，以该重组质粒为模板，P1：5’‑TTGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACAC‑3’为上游引物，P2：5’‑GGGATATCTTAGCCAATGGCACTCAGCGC‑3’为下游引物，并引入SalI和EcoRV两个酶切位点，经过PCR扩增得到双顺反子表达盒；（2）将上述双顺反子表达盒PCR扩增，其产物进行切胶回收，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中，利用该穿梭质粒的多克隆位点上下游分别具有的PCMV启动子和PolyA尾被分别转录和翻译；（3）将步骤（2）获得的重组穿梭质粒pShuttleCMV‑NTN‑TH用PmeI和CIAP分别线形化和5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy‑1同时电转感受态细胞BJ‑5183；（4）涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，用PacI酶切，切出3.0kb和4.5kb的片段为阳性克隆，得到pShuttleCMV‑NTN‑TH和pAdEasy‑1同源重组的重组腺病毒质粒；（5）将步骤（4）筛选出的重组腺病毒质粒经过鉴定后转化XL‑10(Gold)宿主菌,大量扩增上述质粒后抽提，使上述质粒浓度达到0.1ug/ul，线性化并转染AD‑293细胞，在AD‑293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。