[发明专利]表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程，特别是表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法。

背景技术

帕金森氏病（Parkinson’s Disease）是一种中枢神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死、多巴胺（DA）合成减少为特征的神经系统退行性疾病。主要临床表现：静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常，最后患者多死于由肺部感染引起的并发症。帕金森氏病主要发病于60岁以后，随着老龄人口的增加，在今后的10-15年中帕金森氏病的患病人数以及由此对国家和社会带来的经济负担将是巨大的。全世界已有高达400万的患病人数，而大约一半在我国。现阶段对于帕金森氏病的最有效的治疗方法是服用左旋多巴,长期服用左旋多巴会产生副作用，即症状波动和异动症。而手术治疗的效果对帕金森症状的缓解远远不及左旋多巴。由于神经细胞死亡后不能再生，目前临床上的治疗方法仅能缓解症状，不能从根本去除病因，也不能延缓疾病的进展，因此，必须寻找一种能够有效地抑制帕金森疾病而又无明显副作用的治疗方法。

基因治疗是一种新兴的疾病治疗方法，它主要通过病毒或非病毒载体将治疗基因递送到患者体内，研究表明，帕金森氏病的病理改变主要局限在黑质多巴胺能神经元的变性死亡，基因治疗的靶区明确，这非常有利于进行基因治疗的操作。神经营养因子（Neurturin，NTN）和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是帕金森氏病基因治疗的重要基因。实验证明，前者能在体外选择性地促进培养的大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元的存活，促进神经元轴突纤维的生长和对多巴胺高亲和力摄取；后者是多巴胺生物合成过程中的限速酶，能催化酪氨酸转化成为左旋多巴（L-DOPA），左旋多巴在体内进一步生成多巴胺，增加TH的表达，可以促进酪氨酸向左旋多巴的转化，提高多巴胺的合成。目前，针对帕金森氏病的基因治疗主要采用单一治疗基因构建到不同的载体上，使治疗基因在动物模型中表达。国外目前有人采用酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase TH）和GTP环水解（GTP-Cyclohydrolase）组合对帕金森氏病的小鼠模型进行了基因治疗，取得了良好效果。与国外比较，国内使用的载体种类或载体的优越性方面远远落后，尚未构建双顺反子载体治疗帕金森氏病。

发明内容

本发明目的是表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，并通过检测其生物学活性证实所构建的该双顺反子重组腺病毒在感染的宿主细胞中得到成功地共表达。

本发明目的通过以下方式实现：

表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

（1）首先利用EcoRV和Xhol酶切位点将NTN基因插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点B中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN，再通过BamHI和EcoRI酶切位点将TH基因插入该质粒多克隆位点A中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN-TH，以该重组质粒为模板，P1：5’-TTGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3’为上游引物，P2：5’-GGGATATCTTAGCCAATGGCACTCAGCGC-3’为下游引物，并引入SalI和EcoRV两个酶切位点，经过PCR扩增得到双顺反子表达盒；

（2）将上述双顺反子表达盒PCR扩增，其产物进行切胶回收，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中，利用该穿梭质粒的多克隆位点上下游分别具有的PCMV启动子和PolyA尾被分别转录和翻译；

（3）将步骤（2）获得的重组穿梭质粒pShuttleCMV-NTN-TH用PmeI和CIAP分别线形化和5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183；

（4）涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，用PacI酶切，切出3.0kb和4.5kb片段为阳性克隆，得到pShuttleCMV-NTN-TH和pAdEasy-1同源重组的重组腺病毒质粒；

（5）将步骤（4）筛选出的重组腺病毒质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold)宿主菌,大量扩增上述质粒后抽提，使上述质粒浓度达到0.1ug/ul，线性化并转染AD-293细胞，在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。

上述步骤（5）中，重组腺病毒质粒在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒方法是：