[发明专利]表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法

权利要求书

1.表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

（1）首先利用EcoRV和Xhol酶切位点将NTN基因插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点B中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN，再通过BamHI和EcoRI酶切位点将TH基因插入该质粒多克隆位点A中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN-TH，以该重组质粒为模板，P1：5’-TTGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3’为上游引物，P2：5’-GGGATATCTTAGCCAATGGCACTCAGCGC-3’为下游引物，并引入SalI和EcoRV两个酶切位点，经过PCR扩增得到双顺反子表达盒；

（2）将上述双顺反子表达盒PCR扩增，其产物进行切胶回收，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中，利用该穿梭质粒的多克隆位点上下游分别具有的PCMV启动子和PolyA尾被分别转录和翻译；

（3）将步骤（2）获得的重组穿梭质粒pShuttleCMV-NTN-TH用PmeI和CIAP分别线形化和5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183；

（4）涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，用PacI酶切，切出3.0kb和4.5kb的片段为阳性克隆，得到pShuttleCMV-NTN-TH和pAdEasy-1同源重组的重组腺病毒质粒；

（5）将步骤（4）筛选出的重组腺病毒质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold)宿主菌,大量扩增上述质粒后抽提，使上述质粒浓度达到0.1ug/ul，线性化并转染AD-293细胞，在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是在步骤（5）中，该重组腺病毒质粒在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒方法是：

（1）将长满T-25细胞培养瓶的AD-293细胞用PBS洗3次，每次10ml；加入1ml浓度为0.125%胰蛋白酶消化细胞，加入10ml生长液（DMEM高糖+10%FBS）重悬细胞，使细胞分散成单个细胞，传入60mm细胞培养皿中，5ml/孔；37℃，5% CO2，培养12小时；转染前用Opti-MEM洗细胞2次，3ml/孔，最后加入3ml Opti-MEM，37℃，5% CO2孵育1小时；

（2）取经过PacI酶切线性化的质粒4ug（50ul）与200ulOpti-MEM混匀；

（3）取10ul Lipofectin2000和240u lOpti-MEM混匀，室温孵育5min后与步骤（2）所混匀的质粒再混匀得到产物，室温孵育20min；

（4）将步骤（1）孵育的细胞取出，晃动平皿，把步骤（3）产物与脂质体的混合物滴加至AD-293细胞中；37℃，5% CO₂孵育6小时后将溶液吸出，加入5ml生长液（DMEM高糖+10%FBS），观察和收集上清液中串珠状病变细胞。