[发明专利]一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA提取及纯化方法

摘要

本发明公开了一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA的提取及纯化方法。首先将表面除菌后的新鲜植物组织剪碎研磨至糊状后浸泡在灭菌的磷酸盐缓冲液中，经恒温摇床震荡1小时使微生物细胞从植物组织中脱离出来，静置，悬浮液转入离心管中离心收集微生物菌体，然后加入裂解液振荡混匀使DNA从细胞中释放，再经氯仿-异戊醇反复抽提蛋白，异丙醇离心沉淀和70％冰乙醇洗涤，用DNA特异离心吸附柱纯化得到的粗提基因组总DNA，最后再利用特殊引物进行PCR扩增即可回收得到高质量的用于后续分析的植物内生菌特异性DNA片段。本发明方法具有简单、有效、高质量、污染小等优点，为全面完整地研究植物内生菌群落结构提供了高质量的保证。

主权项

一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)新鲜植物组织的表面除菌：依次用70％无水乙醇和2.5％的次氯酸钠，浸泡40s和10min，每100ml2.5％的次氯酸钠加一滴吐温80；再用灭菌的去离子水冲洗3遍，最后一遍同时用超声波处理2‑5min，以保证植物组织表面不存在微生物细胞；(2)微生物的收集：将植物组织剪成0.1‑0.5cm碎片至研钵中，研磨至糊状后用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗至锥形瓶中，加入玻璃珠，150r/min摇床震荡1小时使微生物细胞从植物组织中游离至溶液中，静置后将悬浮液转入无菌的离心管中，12000×g离心15min收集菌体，再次洗涤后离心弃上清；(3)总DNA的提取：先后用SDS、蛋白酶K和CTAB‑NaCl溶液处理，使菌体裂解释放出DNA，然后经氯仿‑异戊醇反复抽提蛋白后用预冷的异丙醇沉淀，得到的粗提DNA再用70％的无水乙醇洗涤、真空干燥后溶于含RNaseA的TE缓冲液中；(4)总DNA的纯化：粗提的DNA溶液经异丙醇和氯化钠溶液低温沉淀后，加入至DNA特异离心吸附柱内离心收集，吸附柱上的DNA经70％乙醇洗涤再用TE缓冲液洗脱，得到纯化的总DNA溶液；(5)内生菌16S rDNA片段的获得：选择扩增细菌16S rDNA的引物，对纯化后的总DNA进行PCR扩增，将细菌和掺杂的植物DNA片段分开，使用柱离心式琼脂糖胶DNA回收试剂盒将细菌16S rDNA片段纯化回收，即可得到用于后续分析的内生菌基因片段。