[发明专利]一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA提取及纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA的提取及纯化。

背景技术

健康植物组织(包括根、茎、叶、果实等)内部都普遍存在着微生物群，它们在植物体内不仅积极地生存着，而且还能产生许多生物学作用。作为一种天然生物资源，它具有广阔的理论研究价值和开发应用前景。通过对植物内部微生物群落的研究既可以了解内生菌的种群分布，又可以探寻其有利于宿主植物生长的生理功能，为农业的可持续发展和环境污染生物修复提供丰富的微生物资源，因此对植物内生菌的研究具有重要的理论意义和实际意义。

传统的研究环境中微生物群落结构主要基于纯培养的方法，即分离纯化微生物，再对微生物的DNA进一步的研究。这种方法耗时、繁琐且得到的微生物只占总微生物数量的一小部分，因此获得的微生物群落的信息并不完整。近年来，随着分子生物学理论与技术的发展，基于16SrRNA基因的非培养技术(如DGGE、T_RFLP、基因克隆文库构建等)为揭示自然环境中微生物种类和遗传多样性开辟了一条全新的途径。然而这些技术都是建立在获得高质量、完整的基因组总DNA的基础之上。随着分子生物学的发展，各种提取环境样品总DNA的方法也都陆续建立起来，但是对多种环境样品而言，没有一种方法能适用于所有的环境样品，每一种样品根据其特有的理化和生物学特性，都需要优化出一种特有的提取总DNA的方法。目前对其他环境中如土壤、活性污泥以及水体中的基因组DNA提取的研究较多，但因国内对植物组织内部微生物群落的研究较少，而作为它的研究前提和基础的植物内部微生物基因组总DNA的提取方法更是鲜有报道，这就需要我们寻找一种快速、有效、低成本地获取高质量、高可信度 及完整的基因组总DNA的提取与纯化方法。

发明内容

本发明旨在针对植物组织内生菌这一类特殊样品，在现有的技术方法之上，提供一种新的、简便、效果好的植物内生菌基因组总DNA的提取与纯化方法，以满足对不同植物内部微生物群落结构的研究的需要。

本发明所述的植物内生菌基因组总DNA的提取与纯化方法的具体步骤如下：

(1)新鲜植物组织的表面除菌：依次用70％无水乙醇和2.5％的次氯酸钠，浸泡40s和10min，每100ml2.5％的次氯酸钠加一滴吐温80；再用灭菌的去离子水冲洗3遍，最后一遍同时用超声波处理2-5min，以保证植物组织表面不存在微生物细胞；

(2)微生物的收集：将植物组织剪成0.1-0.5cm碎片至研钵中，研磨至糊状后用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗至锥形瓶中，加入玻璃珠，150r/min摇床震荡1小时使微生物细胞从植物组织中游离至溶液中，静置后将悬浮液转入无菌的离心管中，12000×g离心15min收集菌体，再次洗涤后离心弃上清；

(3)总DNA的提取：先后用SDS、蛋白酶K和CTAB-NaCl溶液处理，使菌体裂解释放出DNA，然后经氯仿-异戊醇反复抽提蛋白后用预冷的异丙醇沉淀，得到的粗提DNA再用70％的无水乙醇洗涤、真空干燥后溶于含RNaseA的TE缓冲液中；

(4)总DNA的纯化：粗提的DNA溶液经异丙醇和氯化钠溶液低温沉淀后，加入至DNA特异离心吸附柱内离心收集，吸附柱上的DNA经70％乙醇洗涤再用TE缓冲液洗脱，得到纯化的总DNA溶液；

(5)内生菌16S rDNA片段的获得：选择扩增细菌16S rDNA的引物，对纯化后的总DNA进行PCR扩增，将细菌和掺杂的植物DNA片段分开，使用柱离心式琼脂糖胶DNA回收试剂盒将细菌16S rDNA片段纯化回收，即可得到用于后续分析的内生菌基因片段。

步骤(1)所述的超声波的工作频率为30KHz。

步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液的成分：19.9g Na₂HPO₄·H₂O，1.27g Na₂HPO₄·2H₂O，H₂O 1L，PH 8.0。