[发明专利]一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA提取及纯化方法

权利要求书

1.一种应用于群落分析的植物内生菌基因组总DNA提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)新鲜植物组织的表面除菌：依次用70％无水乙醇和2.5％的次氯酸钠，浸泡40s和10min，每100ml2.5％的次氯酸钠加一滴吐温80；再用灭菌的去离子水冲洗3遍，最后一遍同时用超声波处理2-5min，以保证植物组织表面不存在微生物细胞；

(2)微生物的收集：将植物组织剪成0.1-0.5cm碎片至研钵中，研磨至糊状后用灭菌的磷酸盐缓冲液冲洗至锥形瓶中，加入玻璃珠，150r/min摇床震荡1小时使微生物细胞从植物组织中游离至溶液中，静置后将悬浮液转入无菌的离心管中，12000×g离心15min收集菌体，再次洗涤后离心弃上清；

(3)总DNA的提取：先后用SDS、蛋白酶K和CTAB-NaCl溶液处理，使菌体裂解释放出DNA，然后经氯仿-异戊醇反复抽提蛋白后用预冷的异丙醇沉淀，得到的粗提DNA再用70％的无水乙醇洗涤、真空干燥后溶于含RNaseA的TE缓冲液中；

(4)总DNA的纯化：粗提的DNA溶液经异丙醇和氯化钠溶液低温沉淀后，加入至DNA特异离心吸附柱内离心收集，吸附柱上的DNA经70％乙醇洗涤再用TE缓冲液洗脱，得到纯化的总DNA溶液；

(5)内生菌16S rDNA片段的获得：选择扩增细菌16S rDNA的引物，对纯化后的总DNA进行PCR扩增，将细菌和掺杂的植物DNA片段分开，使用柱离心式琼脂糖胶DNA回收试剂盒将细菌16S rDNA片段纯化回收，即可得到用于后续分析的内生菌基因片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的超声波的工作频率为30KHz。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液的成分：19.9gNa₂HPO₄·H₂O，1.27g Na₂HPO₄·2H₂O，H₂O 1L，PH 8.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体过程如下：将步骤(2)收集的菌体沉淀重悬于TE缓冲液中，加入10％SDS、10mg/ml蛋白酶K，于37℃下水浴处理60min，每隔10min上下颠倒混匀液体；再分别加入5M的NaCl溶液和CTAB-NaCl溶液，65℃水浴10min，然后再加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，4℃下9000×g离心5min，取上清液加入等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提至蛋白层消失，取上层水相；用预冷的0.6倍体积的异丙醇沉淀2h后，12000×g离心15min得到粗提DNA，再用70％的无水乙醇洗涤、真空干燥后溶于含RNaseA的TE缓冲液中。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的CTAB-NaCl溶液的成分为：4.1g NaCl，10g CTAB，100mlH₂O。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合液中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1；所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)的具体过程如下：将步骤(3)得到的粗提的DNA溶液用0.6倍体积异丙醇和0.1倍体积氯化钠溶液4℃下沉淀2h以上，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特异离心吸附柱内，在4℃，12000×g离心1min，弃去收集管废液，重复上述操作步骤直至粗提DNA溶液离心完毕，吸附柱上的DNA经70％乙醇洗涤2次，再用预先加热至65℃的TE缓冲液100～500μl洗脱，得到纯化的总DNA溶液。

8.根据权利要求1或4或7所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)所述的TE缓冲液的成分为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的扩增细菌16S rDNA的引物包括：

799f：AACAGGATTAGATACCCTG；

1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT。