[发明专利]欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法

摘要

本发明提供一种鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的血清学方法，该方法是针对美洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白的1～23和59～259氨基酸序列，建立美洲型PRRSV Nsp7蛋白的原核重组表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7；针对欧洲型PRRSV Nsp7蛋白表位1～23和59～269氨基酸序列，建立欧洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7的原核重组表达载体pET-32a-LV-ΔNsp7。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。利用经镍柱亲和纯化的美洲型Nsp7蛋白作为包被抗原制备用于美洲型PRRSV抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒；以纯化的欧洲型Nsp7蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法；两种试剂盒的发明可用于PRRSV抗体的分型检测。

主权项

一种鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于步骤如下：1)目的蛋白的表达及纯化：针对Genbank登录号为EF112445的美洲型PRRSV JXA1株的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，构建Nsp7的24aa～58aa缺失的原核表达载体pET‑32a‑JXA1‑ΔNsp7；针对Genbank登录号为AY588319的欧洲型LV株的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，构建Nsp7的24aa～58aa缺失的原核表达载体pET‑32a‑LV‑ΔNsp7，表达纯化蛋白制备美洲型ΔNsp7蛋白抗原和欧洲型ΔNsp7蛋白抗原。2)间接ELISA检测：利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV ΔNsp7分别建立间接ELISA方法，确定美洲型ΔNsp7蛋白抗原包被浓度为0.5ug/ml，欧洲型ΔNsp7蛋白抗原包被浓度为0.5ug/ml；抗原包被条件均为37℃包被1h加4℃过夜；血清的稀释度和反应时间均为1∶80，1h；使用5％的脱脂奶粉封闭，封闭时间均为1h，HRP‑兔抗猪IgG的使用浓度和反应时间均为1∶35000，1h；常温下，底物反应时间为10min。