[发明专利]欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域内的动物疾病诊断技术，以PRRSV JXA1株和LV株的相似的抗原表位24aa～58aa缺失的Nsp7基因表达蛋白作为抗原，建立了一种鉴别欧、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法。

背景技术

按照2005年国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第八次报告，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Procine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)在分类上属动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)。根据各分离株的序列分析及血清学试验结果将PRRSV分为两个型分别为欧洲型(代表毒株为LV)和北美洲型(代表毒株为VR2332)，前者主要流行于欧洲地区，后者主要流行于美洲和亚太地区。

1987年该病首次在美国的衣阿华、北卡罗纳等州暴发，并在全美迅速蔓延，随后在短短的几年，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区。1991年荷兰中央兽医研究所用猪肺泡巨噬细胞首次分离到病原，并命名为Lelystad病毒(PRRSV欧洲型代表株)；1992年美国研究人员用CL2621细胞也分离到PRRSV(美洲型代表株VR2332)。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到PRRS病毒，从而证实了本病在我国的存在。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为主要特征。该病几乎在所有的国家流行，严重影响养猪业的发展。

我国在2006年春夏交接之际，南方地区发生了以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，而后迅速蔓延至周边地区，至2007年已遍及全国绝大部分省份，对我国养猪业造成巨大损失，涉及十几个省的2000000头猪发病，且造成400000头猪死亡。2007年1月，农业部最终确定“高热病”即“高致病性蓝耳病”。

同时，欧洲型PRRSV在我国的发生也已有报道，并从浙江宁波地区和福建地区的临床发病猪场中检测到了欧洲型PRRSV，其部分序列在GenBank中的登录号为EF473138和EF592535，该序列与疫苗株AMERVAC-PRRS/A3弱毒疫苗株序列的同源性较高。欧洲型PRRSV弱毒疫苗的使用增加了国内PRRSV流行的复杂性，而且在自然界中还有可能发生病毒重组，我们实验室于2009年分别在内蒙和北京分离到两株欧洲株(登录号：GU047345和GU047344)。两者与LV株的同源性分别为87.01％，91.48％。

目前，对猪蓝耳病的预防和控制是世界各国面临的难题，为了更好的预防和控制本病的发生和流行，当务之急是要建立一种可靠的、适于大规模诊断与检测PRRS的方法。PRRS感染常用的分型诊断方法包括建立在免疫学基础和基因差异基础上。在免疫学基础上，有文献记载可以利用针对M蛋白的单抗建立的可鉴别NA-PRRSV和EU-PRRSV的间接免疫荧光技术，但无商品化的试剂盒；以分子生物学为基础的诊断主要依据PRRSV的ORF5、ORF6、ORF7和3’NCR等在NA-PRRSV和EU-PRRSV之间同源性较低差异显著的基因片段建立的基因分型技术，方法包括常规RT-PCR、PCR-RFLP、荧光定量RT-PCR等，如由中国动物疫病预防控制中心研制、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的鉴别NA-PRRSV和EU-PRRSV的荧光定量RT-PCR试剂盒。但是这些诊断方法在应用中需要特殊的仪器和设备、耗时长、工作量大，已不能满足当前诊断PRRS感染的需要，特别是不适合大规模的临床样品检测与开展流行病学调查。

本研究在Nsp7蛋白的基础上剔除了欧洲型和美洲型PRRSV型间的相似的抗原表位，利用原核表达的融合蛋白作为抗原，建立一种适用于大规模检测PRRSV抗体的鉴别间接ELISA方法，以期为我国PRRSV型间抗体的鉴别提供一种快捷的技术手段。

发明内容

本发明的目的是研制一种能够区分欧洲型、美洲型的PRRSV抗体检测试剂盒，最终为大规模的临床样品的检测与开展流行病学调查提供ELISA检测方法。

本发明专利是通过以下技术方案实现的：