[发明专利]欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法

权利要求书

1.一种鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于步骤如下：

1)目的蛋白的表达及纯化：

针对Genbank登录号为EF112445的美洲型PRRSV JXA1株的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，构建Nsp7的24aa～58aa缺失的原核表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7；针对Genbank登录号为AY588319的欧洲型LV株的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，构建Nsp7的24aa～58aa缺失的原核表达载体pET-32a-LV-ΔNsp7，表达纯化蛋白制备美洲型ΔNsp7蛋白抗原和欧洲型ΔNsp7蛋白抗原。

2)间接ELISA检测：

利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV ΔNsp7分别建立间接ELISA方法，确定美洲型ΔNsp7蛋白抗原包被浓度为0.5ug/ml，欧洲型ΔNsp7蛋白抗原包被浓度为0.5ug/ml；抗原包被条件均为37℃包被1h加4℃过夜；血清的稀释度和反应时间均为1∶80，1h；使用5％的脱脂奶粉封闭，封闭时间均为1h，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度和反应时间均为1∶35000，1h；常温下，底物反应时间为10min。

2.根据权利要求1所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，针对美洲型PRRSV ΔNsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为0.35，即当样本OD450≥0.35，判定为阳性；当样本OD450＜0.35，判定为阴性。

3.根据权利要求1-2所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，针对欧洲型PRRSV ΔNsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为0.4，即当样本OD450≥0.4，判定为阳性；当样本OD450＜0.4，判定为阴性。

4.根据权利要求1-3所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，美洲型PRRSV ΔNsp7蛋白和欧洲型PRRSV ΔNsp7蛋白皆不与CSFV、PRV、JEV、PPV阳性血清发生交叉反应。

5.根据权利要求1-4所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，阻断试验结果显示随血清稀释倍数的增加，经阻断的阳性血清与阴性血清OD450值逐渐接近，当血清稀释到640～1280倍时，达到完全阻断。

6.根据权利要求1-5所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，美洲株血清样品检测时，与法国LSI试剂盒进行比较，其敏感性和特异性分别是90％和94.2％，符合率为92.2％。

7.如权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，制备pET-32a-JXA1-ΔNsp7所用的引物对为：

JXA1-Nsp7-F1-GCGGATCCTCGCTGACTGGTGCCCTC

JXA1-Nsp7-R1-CCATGGTGCCTCGGACCTTATCAACATCAGTCCATTTCGTAAGGAAATC

JXA1-Nsp7-F2-GATTTCCTTACGAAATGGACTGATGTTGATAAGGTCCGAGGCACCATGG

JXA1-Nsp7-R2-CCCAAGCTT TTCCCACTGAGCTCTTCTATTC

8.如权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，制备pET-32a-LV-ΔNsp7所用的引物对为：

LV-Nsp7-F3-CGGAATTCTCCCTAACGGCTGCTTTAGCTTG

LV-Nsp7-R3-GACAAAACTCCTTTCATTTTGTCAATGTTCGTTAAGCTGGACAAAAAATCA

LV-Nsp7-F4-TGATTTTTTGTCCAGCTTAACGAACATTGACAAAATGAAAGGAGTTTTGTC

LV-Nsp7-R4-CCCAAGCTTTTTCAAGGCAGTTGTCAGGC