[发明专利]一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法和试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒，具体涉及一种检测KRAS基因12、13密码子突变的方法和试剂盒。该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水，特异性探针、野生型对照，其特征在于，DNA聚合酶为HotStarTaqDNA聚合酶，荧光染料为SYTO9荧光染料，1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；2）对上述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应完成后，将PCR产物再进行变复性；3）对上述PCR扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线先下降。

主权项

一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；2）对上述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应完成后，将PCR产物再进行变复性；3）对上述PCR扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线先下降；步骤2）中，PCR扩增使用的特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液、2μl PCR缓冲液（10×）、0.6‑1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1‑0.3μl HotStarTaq DNA聚合酶、100‑200nM正向引物和100‑200nM反向引物、2‑5μl SYTO 9 荧光染料，其余为水；PCR扩增的过程为：95℃ 15分钟，95℃ 10‑15秒，60℃ 10‑15秒，72℃ 10‑15秒，进行20‑25个循环，81℃ 10‑15秒，60℃ 10‑15秒，72℃ 10‑15秒，进行15个循环；72℃ 2分钟；反应完成后，将PCR产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。