[发明专利]一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法和试剂盒

权利要求书

1. 一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2）对上述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应完成后，将PCR产物再进行变复性；

3）对上述PCR扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线先下降；

步骤2）中，PCR扩增使用的特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；

每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液、2μl PCR缓冲液（10×）、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl HotStarTaq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和100-200nM反向引物、2-5μl SYTO 9 荧光染料，其余为水；

PCR扩增的过程为：95℃ 15分钟，95℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行20-25个循环，81℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行15个循环；72℃ 2分钟；

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中加入的DNA提取液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，PCR扩增产物样本进行熔解曲线分析时，以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

4. 一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水和野生型对照，其特征在于，DNA聚合酶为HotStarTaq DNA聚合酶，荧光染料为SYTO 9 荧光染料，特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6。

5. 一种检测人结直肠癌KRAS基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2）对上述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应完成后，将PCR产物再进行变性熔解；

3）对上述PCR扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线先下降；在通过PCR扩增产物的熔解曲线确定突变后，如果扩增产物在探针区的熔解曲线也先下降，则说明突变发生在密码子12、13的位置，而不是PCR扩增片段的其他区域；

步骤2）中，PCR扩增使用的特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；特异性探针SEQ ID No：7；

每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液、2μl PCR缓冲液（10×）、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl HotStarTaq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、2-5μl SYTO 9 荧光染料，100-200nM特异性探针其余为水；

PCR扩增的过程为：95℃ 15分钟，95℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行20-25个循环，81℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行15个循环；72℃ 2分钟；

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。