[发明专利]一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒，具体涉及一种检测KRAS基因12、13密码子突变的方法和试剂盒。

背景技术

基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族的各成员相互间同源性可达85%。RAS基因编码的蛋白质是P21蛋白，分子量为21KD，由188-189个氨基酸组成，也称之为P21高度相关蛋白。P21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增生信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%。

美国国家癌症综合网络(NCCN) 2010年版的临床指南4中明确指出：KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%。NCCN指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物（西妥西单抗、帕尼单抗）产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。欧盟也明确规定，帕尼单抗的适应症为KRAS野生型的结直肠癌患者。因此KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

但是，尽管KRAS基因突变的意义已得到公认，但是目前全球范围内仍缺乏标准化的检测方法。

传统的直接测序方法一直是公认的“金标准”，但是这种方法的灵敏度低，要求突变率达到20%-30%时才能检出，因此需要显微切割或选择性组织抽提来富集突变细胞。且费用高、通量低、检测周期长，临床应用局限性大。

限制性片段多态性分析（RFLP）虽然具有较高的灵敏度，但所检测的突变位点必须具有限制性内切酶的酶切位点，实际设计和操作复杂。

高效变性液相（dHPLC）的灵敏度在5%-10%之间，但只能区分杂合型样本，当检测纯合型样本时，需要掺入野生型样本混合成杂合型来检测，带来额外的检测费用、延长了检测周期。

上面的几种检测方法由于自身的缺陷，在临床应用方面局限性较大，至今仍然只是作为一种检测方法，而非成品试剂盒。

而目前欧洲比较流行的检测KRAS的分子信标-扩增阻滞系统（molecular beacon-ARMS）的技术，已做成试剂盒，也是全世界唯一的一个成熟的KRAS检测试剂盒，灵敏度可达1%左右，但一个样品就要检测8管反应，还需要分子信标探针，单个样品的操作繁琐、且成本很高。

高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。

现有技术中，采用高分辨率熔解分析KRAS基因突变的报道有：

1、陈志红等人报道了一种HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS基因突变的方法，应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况，并与直接测序法的结果进行比较分析，结果HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可获得检测结果。HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变，其检测灵敏度达10%；HRM法从60份大肠癌患者组织标本中，检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%)；直接测序法检出15份(25.0%)突变，2份未检出KRAS基因突变，HRM法检测的敏感度为100%(15/15)，特异度为96%(43/45)，可见：HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时，具有操作简便、快速、灵敏，单管避免污染等优点（参见：陈志红.中华检验医学杂志. 2010 33(3) ）。